加减归肾丸抗卵巢衰老的作用机理与物质基础研究

This project is focused on the mechanism and substance base investigation of the TCM formulation Jiajian Guishen Pills on ovarian failure, developed by Prof. Yuzhen Zhang who is a well-known gynecologic expert in Guangdong Province. The traditonal classical indicators will be employed such as sex hormone in serum, inhibin and anti Mullerian hormone. Further research will be carried out based on metabolomics, high content screening (HCS) and subtance base. (1) D-galactose will be used to establish a mouse model of ovarian failure.(2)Sex hermone, inhibins and anti Mullerian hormone in serum will be detected to reflect the adjustment activity of drug.(3)Investigation of metabolomics and HCS of ovarian granule cells will be performed to indicate the variation of endogenous metabolites as well as the variation of characterization, structure and function of ovarain granule cells. Based on the research on granule cells, the mechanism of anti ovarian failure of Jiajian Guishen Pills will be recovered.(4)UPLC/MS will be used to analyze the raw materials, components moved in blood to basicly reveal the substance base of Jiajian Guishen Pills for anti ovarian failure.(5)The basic network of mechanism and substance base will be established to reveal the scientification of Jiaian Guishen Pills on anti ovarian failure.

在检测药物干预对实验动物血清中性激素、抑制素、抗苗勒激素等经典指标调控的基础上，采用代谢组学与高内涵筛选等新的研究手段，围绕卵巢颗粒细胞，从其形态、功能、内源性代谢产物变化的角度，探讨广东省著名妇科专家张玉珍教授的经验方加减归肾丸抗卵巢衰老的作用机制，并初步进行物质基础研究：（1）采用D-半乳糖制造小鼠卵巢衰老模型。（2）检测药物干预对小鼠血清中性激素、抑制素、抗苗勒激素水平等常规指标的调控。（3）进行卵巢颗粒细胞的代谢组学与高内涵筛选研究，明确细胞内源性代谢产物的变化，明确细胞形态、结构、功能等的变化，从卵巢颗粒细胞的层面深入阐释加减归肾丸抗卵巢衰老的作用机制。（4）采用UPLC/MS进行原药、入血成分有效物质基础研究，初步明确加减归肾丸的有效物质基础。（5）构建作用机理与物质基础网络，揭示内在联系，阐释加减归肾丸组方的科学内涵。

本项目在检测中药干预对卵巢衰老模型小鼠的血清中性激素、抑制素、抗苗勒激素等指标调控的基础上，采用代谢组学、高内涵筛选等研究手段，围绕卵巢颗粒细胞，从其形态、功能、内源性代谢产物变化的角度，探讨加减归肾丸方剂的抗卵巢衰老的作用机制，并结合入血成分分析，初步进行物质基础研究。.（1）采用D-半乳糖制造了小鼠卵巢衰老模型。（2）药物干预对小鼠血清中激素水平的调控：模型小鼠口服加减归肾丸水煎剂浓缩浸膏，观察卵巢的组织形态学特征，并测定血清中促性腺激素释放激素（GnRH）、血清促滤泡生成激素（FSH）、促黄体生成激素（LH）、雌二醇（E2）、血清抑制素B（INHB）以及抗苗勒激素（AMH）水平。结果表明，口服加减归肾丸水煎剂浓缩浸膏可改善模型小鼠卵巢颗粒细胞的细胞核形态、异染色质以及线粒体等微观结构，可不同程度改善GnRH、FSH、LH、E2以及AMH等激素水平，表明加减归肾丸具有一定的延缓卵巢衰老的作用。（3）卵巢颗粒细胞的高内涵筛选（HCS）研究表明，卵巢颗粒细胞采用含药血清干预后，对细胞进行染色，采用高内涵筛选系统观察，发现空白组、E2含药血清、加减归肾含药血清对细胞的形态、功能、凋亡等作用不明显，分析原因，可能系正常细胞不敏感所致。取大鼠卵巢颗粒细胞进行培养，采用氯化镉造成细胞损伤模型，采用含药血清干预后，对细胞进行染色，采用高内涵筛选系统观察，发现空白组与模型组的细胞在形态、功能、凋亡等方面具有显著差异，表明造模成功，E2含药血清、加减归肾含药血清对细胞的形态、功能、凋亡等作用具有一定的作用。（4）细胞代谢组学研究：取大鼠卵巢颗粒细胞进行培养，采用氯化铬造成细胞损伤模型，采用E2含药血清、加减归肾含药血清对细胞进行干预后，采用HPLC-Q-TOF MS进行检测，分析正常组与模型组间成分差异，进一步比较药物干预后成分的变化情况，结果表明药物干预对细胞的代谢网络有一定的干预作用。（5）入血成分分析：采用HPLC/Q TOF MS进行原药、入血成分有效物质基础研究，初步探讨了加减归肾丸的入血成分。.该项目研究结果可为加减归肾丸方剂抗卵巢衰老的作用提供一定的参考，亦为同类研究提供一定的参考借鉴。细胞层面的代谢组学研究、入血成分的分析确定有待今后进一步深入研究。