云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI对其PMNs呼吸爆发的影响及分子机制

The Yunnan Saba pig is the excellent local breeding, which is the material of famous Yunnan Xuanwei ham. Recently, the incidental or consequential porcine colibacillosis by pathogenic E. coli infection is still vital factor threaten to the healthy development of swine industry. In this research, the pathogenic E. coli of Yunnan Saba pig will be the object of study, and its dominant serotype and high pathogenic island (HPI)'s molecular epidemiology trait will be studied, and the effects and molecular mechanism of HPI gene on Saba pig poly morphonuclear leukocytes (PMNs)'s respiratory burst will be explored by Real-time PCR, gene deletion and mutation, FCM, Laser confocal microscopy, immunocytochemistry etc. we expect to elucidate the molecular epidemic and evolution regularty of the Yunnan Saba pathogenic E. coli's HPI, and to reveal the molecular pathogenic mechanism of HPI on the Yunnan Saba pig's PMNs infected by Yunnan Saba pathogenic E. coli from respiratory burst angle. The results are very important scientific significance for enriching and promoting the cognitive level between pathogenic E. coli and cells, which can provide the novel approach to prevent and control of colibacillosis.

云南撒坝猪是优良的地方品种，是著名的制作云南宣威火腿的原料猪。近年来，致病性大肠杆菌感染所引起的原发性或继发性猪大肠杆菌病仍然是严重威胁我省特色养猪业健康发展极其重要的因素。本项目以云南撒坝猪致病性大肠杆菌为研究对象，运用Real-time PCR、基因缺失突变、流式细胞术、激光共聚焦显微技术、免疫细胞化学等现代分子生物学技术，研究云南撒坝猪致病性大肠杆菌优势血清型菌株与耶尔森强毒力岛(HPI)的分子流行病学特点，探讨云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI基因对撒坝猪多形核白细胞(PMNs)呼吸爆发的影响及其作用的分子机制。以期阐明撒坝猪致病性大肠杆菌HPI的分子流行和进化规律，并从呼吸爆发的角度揭示致病性大肠杆菌感染撒坝猪PMNs过程中毒力因子HPI的分子致病机制，对于丰富并提升致病性大肠杆菌与细胞相互作用的认识水平具有重要的科学意义，为大肠杆菌病的防制提供新的思路。

近年来致病性大肠杆菌对养猪业危害较大，本研究主要对撒坝猪致病性大肠杆菌耶尔森强毒力岛(High Pathogenicity Island, HPI)基因进行检测及序列分析，研究HPI的分子流行病学特点及遗传进化规律；构建撒坝猪致病性大肠杆菌优势血清型HPI基因缺失株，鉴定其摄铁功能、耐药性和致病性的异同；利用携带有HPI的致病性大肠杆菌和HPI缺失株体外感染撒坝猪PMNs，分析两者所导致PMNs呼吸爆发的分子致病机制，探讨HPI的泛素化过程，以期揭示HPI在致病性大肠杆菌中的作用及其分子机制。.研究结果显示：1.发现HPI在撒坝猪致病性大肠杆菌中普遍存在，有水平转移的现象；2.在撒坝猪致病性大肠杆菌中，O3、O4、O24为优势血清型，分别占定型菌株的22.61%、17.86%和11.90%；3. 分离鉴定的优势血清型大肠杆菌中HPI的核心功能区irp2基因与GenBank 中提供的irp2基因序列同源性高达100%，扩增出的fyuA 基因与 GenBank 中提供的fyuA 基因序列的同源性大于99.3%。通过序列比对与进化树分析，分离的E.coli HPI阳性菌株与E.coli IHE3034亲缘关系较近，而E.coli IHE3034在GenBank中被描述为致病菌；4.利用Red同源重组技术成功构建了E.coli(E) HPI irp2基因缺失株，通过对比HPI亲本株与缺失株，研究发现HPI的存在与否直接影响E.coli 摄铁蛋白HMWPs的表达，缺失株的摄铁功能显著低于亲本株，但HPI的缺失不影响大肠杆菌的形态、生化指标；5.含有 HPI 的大肠杆菌具有较强的致病性，E.coli HPI缺失株较HPI亲本株的耐药性与致病性均有所减弱；6.HPI可通过抑制ROS的产生来降低中性粒细胞呼吸爆发的能力，增强E.coli的致病性；7.HPI诱导HSP70和Ca2+的表达是降低中性粒细胞呼吸爆发能力的机制之一；8.撒坝猪致病性大肠杆菌感染可激活TLR4/NF-κB信号通路，HPI亲本株较缺失株的激活作用明显，该激活作用是通过泛素化降解IκB-α实现的。.本研究结果揭示了HPI在撒坝猪致病性大肠杆菌中的作用及其分子机制，具有一定的科学意义，为有效防控致病性大肠杆菌奠定了理论基础。