Cul2-KLHDC3 E3泛素连接酶复合体调控ARF依赖性铁死亡的分子机制研究

Ferroptosis is an iron-dependent, non-apoptotic form of cell death characterized by accumulation of intracellular reactive oxygen species. Ferroptosis is closely related cell metabolism,tumorigenesis and progression, but its mechanism and regulation are not yet clear. In previous work, we found a gene, KLHDC3, that is up-regulated in ovarian cancer. KLHDC3 is a Cullin2 family of E3 ubiquitin ligase substrate recognition subunit, but its function is unknown. Knockdown of KLHDC3 expression in ovarian cancer cells did not affect cell proliferation and apoptosis. By means of protein affinity purification mass spectrometry, we found that the tumor suppressor protein p14ARF is a novel KLHDC3 interactor. Subsequent studies found that KLHDC3 mediates ubiquitination of ARF. ARF accumulation in KLHDC3 knockout cells inhibits the expression of SLC7A11 and decreases cystine uptake, which in turn limits the primary antioxidant, glutathione (GSH) production, and promotes ferroptosis. This project will study the molecular mechanism of KLHDC3-mediated ovarian cancer tumorigenesis and progression by inhibition of ARF-mediated ferroptosis.

铁死亡(ferroptosis)是一种铁依赖性的，以细胞内活性氧堆积为特征的非细胞凋亡形式的细胞死亡。铁死亡与代谢和肿瘤发生发展密切相关，但其机理和调控方式还不太清楚。在前期工作中，我们发现了一个在卵巢癌中显著上调表达的基因KLHDC3。KLHDC3是一个Cullin2家族的E3泛素连接酶底物识别亚基，但功能未知。卵巢癌细胞中敲除KLHDC3的表达不影响细胞的增殖和凋亡。我们通过蛋白质亲和纯化质谱的方法，发现肿瘤抑制蛋白p14ARF是KLHDC3的互作蛋白。后续研究发现KLHDC3介导了ARF的泛素化降解。KLHDC3敲除细胞中ARF积累抑制了SLC7A11的表达，降低了胱氨酸的摄取，进而限制了细胞主要的抗氧化剂-谷胱甘肽(GSH)生成并促进铁死亡。本项目将研究KLHDC3在卵巢癌上调抑制ARF介导的铁死亡，进而促进卵巢癌发生发展的分子机制。

半胱氨酸/谷氨酸逆向转运体SLC7A11(俗称XCT)的功能是输入半胱氨酸用于谷胱甘肽的生物合成，从而保护细胞免受氧化应激和铁死亡的影响，铁死亡是一种受调控的非凋亡性细胞死亡形式，由基于脂质的活性氧物(ROS)的积累驱动。P14ARF是一著名的肿瘤抑制因子，通过抑制NRF2介导的SLC7A11转录促进铁死亡。在这里，我们证明了cullin 2 RING E3连接酶(CRL2)-KLHDC3 E3泛素连接酶复合体在调节p14ARF蛋白稳定性中的关键作用。KLHDC3在卵巢癌中显著上调表达。KLHDC3、CUL2和RBX1蛋白组装成一个E3泛素连接酶复合体，介导了p14ARF的泛素化降解。KLHDC3高表达导致的p14ARF蛋白水平下降解除了p14ARF对NRF2的抑制作用，促进了NRF2介导的SLC7A11表达，抑制铁死亡，从而达到促进肿瘤的目的。我们还发现p14ARF C末端的一个RGPG基序是其结合KLHDC3所必需。该基序在小鼠同源蛋白p19arf中是不存在的，实验也证实小鼠的Klhdc3对p19arf没有调控作用。这一现象可能和人、鼠在进化过程中不同的肿瘤抑制途径有关。总之，这些发现揭示了p14ARF的蛋白质稳定性和前铁死亡功能是由CRL2 E3泛素连接酶复合体调控的，并表明KLHDC3过表达抑制p14ARF-NRF2-SLC7A11调节通路可能有助于癌症的进展。