Nrf2参与缺氧预处理骨髓源间充质干细胞的功能调节与机制研究

Although there has been great progress in the therapy of ischemic heart diseases (such as myocardial infarction) with the transplanting MSCs, there exists the continued ischemic and seriously hypoxic microenvironment in the infarcted myocardium, which largely limited the survivals and the functions of transplanting cells. Some reports show that hypoxic preconditioning results in improved therapeutic potential of stem cells, the precise mechanism in the process remains unclear. Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, also known as Nrf2, is a transcription factor that is encoded by the NFE2L2 gene. Nrf2 induces the expression of various genes including those that encode for several antioxidant enzymes and major detoxication enzymes, and it may play a physiological role in the regulation of oxidative stress and improvement of cell survivals. Therefore, we present a hypothesis in this study that Nrf2 may play a key role in involving of hypoxic preconditioning enhancing survivals and therapeutic potential of transplanting MSCs in the ischemic tissues. In order to confirm the notion, we plan to perform both in vitro cell culture assays and in vivo animal studies using rat models of myocardial infarction with many experimental methods, which could clarify the action and mechanism of Nrf2 in hypoxic preconditioned MSCs and subsequently provide important rationales and experimental evidences for further studies targeted at Nrf2 in medicine development and clinical practice.

间充质干细胞（MSCs）治疗缺血性疾病（如心肌梗死）取得重要进展,但缺血组织持续存在的缺血缺氧微环境不利于移植细胞的存活和功能发挥。研究提示，缺氧预处理可以增强干细胞的治疗潜能，但相关作用机制尚不完全清楚。核因子相关因子-2（Nrf2）是细胞抗氧化应激的重要调节因子，Nrf2激活后可以介导多种抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达，发挥抗氧化应激与促进细胞生存的作用。因此，本课题假设Nrf2参与缺氧预处理诱导增强MSCs治疗潜能，促进移植细胞在缺血组织的生存；拟通过细胞培养实验和心肌梗死动物模型实验，利用常用多种分子生物学技术，检测缺氧预处理引起Nrf2及下游靶基因表达的信号通路分子，以及Nrf2激活对于缺氧条件下MSCs增殖和向心肌、血管生成的定向分化潜能的相关基因表达，全面地阐明缺氧预处理调节MSCs生物学功能的作用和相关机制，为进一步以Nrf2为靶点的基础研究、药物开发和临床应用提供实验依据。

间充质干细胞（MSCs）在机体血管生成和损伤血管内皮修复过程中发挥重要的作用。Nrf2是细胞氧化还原状态的指示剂，是细胞抗缺血缺氧的重要分子之一。缺氧处理MSCs是否通过某种信号途径激活Nrf2，进而发挥增强MSCs抵抗缺血缺氧环境的能力，尚不清楚。本课题主要研究内容：1）检测正常氧浓度和低氧浓度下MSCs中Nrf2及其上下游通路或靶基因mRNA转录和蛋白表达水平变化。2）以干扰Nrf2慢病毒感染MSCs后检测Nrf2下游基因HO-1的转录及蛋白表达水平变化；测定干扰Nrf2后MSCs的生物学特性，包括细胞迁移能力、凋亡和增殖能力及血管生成能力。3）给予PI3K信号通路阻断剂LY294002、PD98059及p38阻滞剂后，观察其对Nrf2及下游基因转录及表达水平的变化。4）建立心肌梗死大鼠模型，缺氧预处理MSCs或携带干扰Nrf2基因慢病毒感染的MSCs行细胞移植治疗心肌梗死，观察MSCs的血管生成作用。实验研究显示，（1）缺氧预处理影响MSCs增殖、凋亡和旁分泌作用，且涉及Nrf2及其下游靶基因的调节。表现为：1）siRNA干扰Nrf2后加重缺氧诱导细胞凋亡，并抑制细胞增殖能力，降低细胞迁移能力；而高表达Nrf2抑制缺氧诱导的细胞凋亡，增强细胞迁移能力，但对细胞增殖能力无影响，这些结果表明，Nrf2有利于维持缺氧微环境中的细胞生存。2）缺氧显著诱导MSCs分泌VEGF和HIF-1α蛋白；但siRNA干扰Nrf2后显著降低缺氧诱导的MSCs分泌VEGF和HIF-1α，相反，过表达Nrf2则显著增加MSCs这种旁分泌功能。（2）Nrf2及其下游靶基因在缺氧预处理的MSCs中具有重要作用，是缺氧预处理增强MSCs抗缺氧能力的重要机制，具体表现在：1）缺氧诱导MSCs产生ROS，并激活Nrf2核内转位。2）缺氧通过诱导细胞PI3K/Akt信号途径激活而促进Nrf2表达增加。3）缺氧诱导MSCs的Nrf2、HO-1和NQO1 mRNA转录和蛋白表达；siRNA干扰Nrf2后显著抑制缺氧诱导的细胞中Nrf2、HO-1和NQO1 mRNA转录和蛋白表达，相反，高表达Nrf2则显著促进缺氧诱导的细胞中Nrf2、HO-1和NQO1 mRNA转录和蛋白表达。这些结果表明Nrf2涉及缺氧预处理增强MSCs存活和细胞功能调节，以Nrf2为靶点可能是细胞治疗的一个方向。