细胞分裂素信号通路转录因子LpARR11调控多年生黑麦草衰老及叶绿素降解的分子机制

Leaf senescence is an important factor affecting the biomass yield and quality of forage grass. Cytokinin (CTK) plays a key role in the inhibition of leaf senescence and chlorophyll degradation. However, its underlying mechanism is still unclear. Our previous results indicate that overexpression of a CTK signaling transcription factor LpARR11 from perennial ryegrass, an important forage grass, delayed the progression of leaf senescence and indirectly suppressed the expression of chlorophyll catabolic genes. In addition, LpARR11 showed interaction with LpABF3, a transcription factor that can promote chlorophyll degradation. Based on the above results, we hypothesize that LpARR11 and LpABF3 co-regulate chlorophyll degradation and further affect leaf senescence process. The following experiments will be carried out to prove the hypothesis: ①suppression and overexpression of LpARR11 in perennial ryegrass to clarify its function; ②understanding the effects of LpARR11 on protein activity and transcriptional activity of LpABF3; ③testing the phenotype of transgenic plants with both LpARR11 and LpABF3 co-overexpressed to uncover the biological effects of the interaction between LpARR11 and LpABF3. The implementation of this project will laid a theoretical foundation and provide crucial genetic resources for the improvement breeding of perennial ryegrass.

叶片衰老是影响饲草产量和品质的重要因素。细胞分裂素（CTK）是抑制叶片衰老和叶绿素降解的关键激素，但分子机制尚不清楚。以重要的冷季型牧草多年生黑麦草为材料，申请人发现，过量表达CTK通路转录因子LpARR11能够延缓叶片衰老，并间接抑制叶绿素降解基因的表达。进一步实验证明，LpARR11能够与叶绿素降解促进转录因子LpABF3互作。在此基础上，我们提出假说：CTK通路转录因子LpARR11与LpABF3协同叶绿素降解等代谢途径，进而影响叶片衰老进程。本项目拟通过以下研究验证该假设：①在黑麦草中敲除及过表达LpARR11，以明确其基因功能；②明晰LpARR11是否影响LpABF3的蛋白稳定性和转录激活活性；③分析共表达LpARR11和LpABF3转基因株系的表型，揭示其互作调控叶绿素降解及叶片衰老的生物学效应。本项目的实施，将为高产优质多年生黑麦草的遗传育种奠定理论基础和提供基因资源。

多年生黑麦草（Lolium perenne）是重要的冷季型草，具有草坪和牧草两种生态型。但其耐逆性不强，如高温、干旱和重金属等逆境容易诱导其叶片早衰。叶片早衰是限制草坪质量和饲草产量及品质的重要因素，而细胞分裂素（CTK）是延缓叶片衰老的关键激素，但其调控叶片衰老的分子途径尚不清楚。前期研究发现，过量表达CTK通路转录因子LpARR11能够延缓叶片衰老，并抑制衰老基因LpSGR表达。本研究进一步开展以下四个方面研究，初步揭示了LpARR11-LpABF3-LpSGR模块调控多年生黑麦草衰老的分子途径：（1）系统进化和功能域分析表明LpARR11属于B类ARR转录因子。荧光定量PCR分析了LpARR11的表达模式，结果表明LpARR11在伸展叶中的表达量高，且受脱落酸和细胞分裂诱导表达。亚细胞定位分析结果表明LpARR11定位于细胞核。过量表达LpARR11显著延缓了拟南芥叶片衰老进程，并抑制了叶绿素降解关键基因SGR的表达。（2）酵母单杂实验表明LpARR11不能够与LpSGR的启动子结合，说明LpARR11通过与其他转录因子互作，协同调控LpSGR表达。采用酵母双杂实验筛选到LpARR11的互作蛋白LpABF3，双分子荧光互补实验、荧光素酶报告基因实验和瞬时表达实验结果表明LpARR11通过抑制LpABF3对于LpSGR的激活，进而发挥延缓叶片衰老的功能。（3）采用主成分分析法（PCA），系统评价了98份多年生黑麦草种质资源的耐热性，发现LpSGR基因的表达与多年生黑麦草种质的耐热性具有显著相关性。因此，LpSGR是一个耐高温候选基因。（4）采用RNA干扰技术，获得RNAi:LpSGR转基因株系，与野生型对照相比转基因株系的衰老进程显著减缓。然而，转基因株系的饲草产量和耐热性却显著下降。我们进一步采用酒精诱导RNAi载体，构建诱导型RNAi:LpSGR转基因株系，酒精诱导型转基因株系的地上部生物量和耐热性得到了改善，因此，酒精诱导型RNAi:LpSGR转基因株系具有较高的应用前景。综上，本研究结论及成果对于培育饲草产量高、品质优的多年生黑麦草新品系具有重要的理论指导与现实意义。