异养硝化-好氧反硝化新菌株DN-7强化去除垃圾渗滤液中总氮的机理研究

Zobellella taiwanensis DN-7 is a newly isolated bacterium capable of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification. DN-7 strain removes total nitrogen (TN) efficiently in the landfill leachate, showing great potential for the treatment of landfill leachate. However, the mechanism of TN removal is unknown. Previous strain’s whole genome sequencing indicates that the ammonia monooxygenase gene (amo) of DN-7 related to ammonia oxidation is different from any known amo genes, although the strain had denitrifying genes. This result strongly suggests that the AMO of DN-7 strain is probably a new one. In this project, we will first study the AMO enzyme and amo gene of DN-7 by purifying the AMO enzyme and analyzing the amo gene sequence by searching the whole genome sequencing data. Then we will built a DN-7 bioreactor for nitrogen removal of landfill leachate, and use qPCR and RT-qPCR techniques to assess the abundance and expression levels of the functional amo gene and denitrifying genes during landfill leachate treatment. Finally, the mechanism of nitrogen removal by DN-7 in the treatment of landfill leachate will be demonstrated by combining and analyzing the data of organic compounds, nitrogen and functional genes. The finding provides the fundamental information for the development of advanced biological nitrogen removal technique in landfill leachate treatment.

Zobellella taiwanensis DN-7是一株新发现的具有异养硝化和好氧反硝化功能的细菌, 可以高效去除垃圾渗滤液中的总氮，显示出巨大的应用潜力，然而其去除总氮的机理不明。先前全基因组测序显示DN-7具有完整的反硝化基因，但不具有已发现的主导氨氧化过程的氨单加氧酶（AMO酶）基因，表明DN-7具有独特的AMO酶和amo基因。本项目以经典柱层析法对DN-7的AMO酶进行分离纯化，以蛋白质质谱和N末端测序技术获取酶的序列并与已有的全基因组序列比对找寻amo基因；以DN-7垃圾渗滤液强化脱氮反应器为平台，利用荧光定量PCR和反转录荧光定量PCR技术研究脱氮过程中功能基因（amo基因和反硝化基因）丰度和基因表达水平的变化，考察有机物和氮素对脱氮基因的影响，阐明DN-7异养硝化和好氧反硝化去除垃圾渗滤液总氮的机制，为垃圾渗滤液生物脱氮技术提供新的理论基础。

一些异养细菌被发现在好氧条件下可以将氨氮转化为氮气，众多研究认为异养硝化好氧反硝化过程是氮气产生的原因。本项目对Zobellella taiwanensis DN-7菌株在好氧条件下的氨氮去除过程进行了研究，最终发现异养硝化-好氧反硝化过程不是DN-7将氨转化为氮气的主要过程，其主要过程为一种全新的氨氧化途径-异养型好氧氨氧化途径（Haammox）。该途径为首先氨在丙酮和氧气存在时氧化为丙酮肟，然后丙酮肟在好氧条件下进一步转化为氮气和丙酮。体系中的丙酮来源于DN-7菌体对有机碳源的转化，而且丙酮的合成对于启动Haammox过程是必要的，丙酮在整个过程中起着类似催化剂的作用。与异养硝化反硝化不同的是，Haammox过程通过两种新型NAD依赖型酶可以为菌株产生能量。一个是丙酮肟合成酶（AOS）催化丙酮和氨在NAD+存在时合成丙酮肟，并产生NADH；另一个是丙酮肟脱氢酶（ADH）催化丙酮肟在NAD+存在时转化为丙酮和氮气，同时产生NADH。本项目对AOS和ADH酶进行了分离纯化和测序鉴定，并将测序结果与菌株全基因组测序数据进行了比对，最终获得了AOS和ADH的序列，将序列在NCBI数据库中进行比对发现这两个蛋白和基因都是功能未知的序列，存在于许多物种中，但是这两种蛋白和基因的序列还需要进一步的研究来予以明确。另外本项目还构建了生物反应器对DN-7去除垃圾渗滤液总氮的过程进行了研究，实验发现额外添加丙酮可以显著增强氨氮和总氮的去除效率，其总氮去除主要经过Haammox过程来完成。总之，本项目研究发现了一种全新的微生物氨氧化途径，提出了一种全新的耦合了有机物和氮代谢的能量产生途径，增加了对自然界微生物氮循环的认识。