VEGF下调Calmodulin维持肝窦内皮细胞窗孔结构在肝纤维化中的作用及机制

To research liver fibrosis is very important for clinical therapy of chronic liver disease. The defenestration of liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) is the prerequisite for activation of hepatic stellate cells and the occurrence of liver fibrosis. According to the previous report and the results of our lab, VEGF is confirmed for maintaining the fenestrae of LSEC. However, the mechanism is still unknown. In prophase research, we found that the expression of calmodulin(CaM) in LSEC increased when the fenestrae was disappearing and this trend could be suppressed after adding VEGF in. So it can be concluded that VEGF sustains LSEC fenestrae through down-regulating the expression of CaM. This project intends to proof the functional relationship between VEGF and CaM by detecting the categorical changes of CaM and possible pathways that mediated by VEGF. Then further analyzes the effect of CaM on VEGF about sustaining LSEC fenestraeand through regulating CaM expression and elucidate the mechanism, which may provide new ideas and solutions for clinical treatment of liver fibrosis.

研究肝纤维化对于治疗慢性肝病具有重要意义。肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）窗孔结构的消失是激活肝星状细胞，引发肝纤维化的前提条件。已有的报道及课题组前期实验均证实VEGF具有维持LSEC窗孔结构的作用，然而其作用机制仍未阐明。我们前期研究发现，钙调蛋白（Calmodulin，CaM）在LSEC窗孔结构消失过程中表达显著上升，而加入VEGF后，其上升受到抑制。由此可以推测，VEGF很有可能通过下调CaM维持LSEC的窗孔结构从而抑制肝纤维化的发生。本课题拟通过研究VEGF下调LSEC中CaM的具体类型及途径，证实VEGF维持LSEC窗孔结构与下调CaM有关，并通过干预CaM的表达深入分析其对VEGF维持窗孔结构的影响，阐明VEGF通过下调CaM维持LSEC窗孔结构的具体作用机制，从而为临床对肝纤维化的治疗提供新的思路及解决策略。

肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）窗孔结构的消失是激活肝星状细胞，引发肝纤维化的前提条件，然而其发生机制仍未阐明。本课题研究发现VEGF具有维持LSEC窗孔结构的作用。而钙调蛋白（Calmodulin，CaM）在LSEC窗孔结构消失过程中表达显著上升。加入VEGF后，其上升受到明显的抑制。由此可以推测，VEGF很有可能通过下调CaM维持LSEC的窗孔结构从而抑制肝纤维化的发生。人体标本上进一步验证CaM与肝纤维化的关系，结果发现，与正常肝组织相比，CaM的蛋白水平在肝纤维化的样本中表达明显上调。由此证实VEGF维持LSEC窗孔结构与下调CaM有关。为深入阐明VEGF通过下调CaM维持LSEC窗孔结构的具体作用机制，本课题从体内体外两个水平探讨相关信号途径。分离培养人肝窦内皮细胞0天及3天，提取细胞总RNA做mRNA表达谱芯片检测，并进行生物信息学统计分析，结果发现对比培养前的细胞，培养后细胞中426个基因出现了表达的上调，352个基因出现了表达的下调。其中我们关注到Hedgehog信号途径相关作用分子参与了这一过程。进一步检测证实Ptch、Smoothed、Gli3这三个Hedgehog信号途径分子在体外培养3天后表达出现了明显的上调，而VEGF维持窗孔结构的过程中都出现了表达回落。VEGF两个主要的受体，VEGFR1和VEGFR2在培养前后以及VEGF刺激后也出现了相应的表达变化。由此，提示VEGF维持窗孔作用是通过其相应的受体作用于Hedgehog信号途径发挥的。动物实验上，首先构建早期肝纤维化小鼠模型，通过给予MCD饮食8周，小鼠肝脏开始出现肝纤维化的改变。继而扫描电镜下观察到，LSEC表面窗孔结构在给予MCD饮食后有不同程度的消失。为了证实Hedgehog信号途径在这一过程中的作用，我们检测了小鼠肝脏中Ptch、Smoothed、Gli3的表达，发现给予MCD饮食后这三个信号分子表达明显上调。进而构建Hedgehog信号途径基因敲除小鼠以及在内皮细胞中特异性敲除Hedgehog信号途径的小鼠，均发现抑制Hedgehog信号途径后可以改善小鼠纤维化的程度，而这一过程与上调VEGF表达有关。由此，本课题探讨了VEGF维持LSEC窗孔结构的具体机制。