AMPK调控的ACE2磷酸化在肺动脉高压中的内皮保护作用

Endothelial dysfunction plays an integral role in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension (PAH). AMP-activated protein kinase (AMPK) and angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) are crucial in endothelial homeostasis. We identify that activation of AMPK phosphorylates ACE2 in endothelial cells (AJRCCM, 2018, accept). Phosphorylation of ACE2 enhances the stability and activity of ACE2. Activation of AMPK can also induce ACE2 at transcriptional and epigenetic level. So we propose to study the role of the AMPK-ACE2 axis in regulating endothelium in vitro and in vivo. We will use multi-level approaches including bioinformatics, epigenetics, and systems biology to investigate the mechanotransduction and transcriptional regulatory network involved in the AMPK-ACE2 axis in endothelial cells. To explore the functional consequence of AMPK-ACE2 in endothelial function in vivo, we will use AMPKα2 endothelial specific knock-out mice (AMPKα2-EC KO) mice and CRISPR/Cas9 technology to create mice harboring ACE2 phosphorylated site mutant. These mice will be used for the investigation of pulmonary hypertension. Also, we will decipher the role of AMPK-ACE2 aix in maintaining a function endothelium and protecting PAH.

内皮功能障碍在肺动脉高压发病中起关键作用。AMP活化蛋白激酶 (AMPK) 和血管紧张素转化酶2 (ACE2) 在维持内皮稳态中发挥着重要作用。我们前期研究发现血管内皮中激活AMPK可以磷酸化ACE2，且发现了ACE2被AMPK磷酸化的位点(AJRCCM，2018，已接收)；磷酸化的ACE2稳定性和活性显著增加；同时我们还发现AMPK对ACE2的转录水平和表观遗传学水平进行调节。因此我们推测AMPK-ACE2轴是维持内皮细胞稳态的关键分子。本项目拟采用生物信息学、表观遗传学及系统生物学等探讨AMPK-ACE2轴影响内皮细胞功能的分子机制，应用AMPKα2内皮特异性敲除小鼠，采用CRISPR/Cas9技术实现ACE2磷酸化位点在体基因定点突变，揭示AMPK对ACE2磷酸化的内皮及肺动脉高压的保护作用，阐明AMPK-ACE2通路的激活在肺动脉高压临床治疗的意义。

血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 具有心血管保护作用。AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 磷酸化 ACE2 Ser-680 可以增加 ACE2 的稳定性。肺血管内皮细胞中 ACE2 的这种翻译后修饰可以保护小鼠肺动脉高压 (PAH) 的发生。鼠双微体基因 (MDM2) 是一种 E3 连接酶，可泛素化底物以导致其降解。在这里，我们表明 MDM2 可以泛素化 ACE2 Lys-788，而AMPK 磷酸化 ACE2 阻碍了这一泛素化过程。AMPK 对ACE2磷酸化降低和 MDM2 对ACE2泛素化增加与PAH的发生发展有关，因此增加 AMPK 活性和/或抑制 MDM2 介导的 ACE2 泛素化的药物可能对 PAH 患者有治疗作用。.SARS-CoV-2 感染依赖于 Spike 糖蛋白 (S 蛋白) 与宿主细胞中的 ACE2 结合。我们表明，S 蛋白可以通过下调 ACE2 并因此抑制线粒体功能来损害血管内皮细胞 (ECs)。为了检测 S 蛋白是否会导致受感染宿主的肺损伤，我们对叙利亚仓鼠通过气管给药的方式感染过表达 S 蛋白的假病毒 (Pseu-Spike)。过表达 Pseu-Spike 的仓鼠肺损伤明显，表现为肺泡间隔增厚和单核细胞浸润增加。 AMPK 磷酸化 ACE2 Ser-680，MDM2 泛素化 ACE2 Lys-788，AMPK 和 MDM2 之间的相互作用决定了 ACE2 的水平。在受损的肺中，磷酸化 AMPK (pAMPK)、磷酸化 ACE2 (pACE2) 和 ACE2 水平下降，但 MDM2 水平升高。用 S1 蛋白处理的 EC 中线粒体碎片增加，表明线粒体动力学发生了改变。此外，在体实验证明S 蛋白可导致内皮功能失调。我们的数据表明，单独的 S 蛋白可以损伤内皮细胞，表现为线粒体功能和 eNOS 活性受损，但糖酵解增加。 ECs 中的 S 蛋白可以增加氧化应激，从而导致 AMPK 失活、MDM2 上调，并最终导致 ACE2 不稳定性增加。