极端噬热菌中parABSm基因位点的遗传结构与功能及parABm的缺失导致子细胞死亡的过程研究

Thermus thermophilus strains are polyploid and the megaplasmid copy number has been estimated to be four or five. There are no reports in the literature regarding the megaplasmid segregation in this organism. The megaplasmid encodes parABS locus homologues of low-copy-number plasmids, termed here parABSm, it contains an operon consisted of parAm and parBm genes, and a centromere-like DNA sequence parSm. In low-copy-number plasmids, parABS acts to ensure proper plasmid segregation in the daughter cell..Our former study suggested that the parABSm system of T. thermophilus is essential for the megaplasmid maintenance. In this project, we aim to:1) generate a parABm gene deletion mutant and analyze it with respect to cell morphology maintenance, cell division process, megaplasmid replication process, and importantly the megaplasmid segregation in the daughter cells. Through this, we address the functions of the parABSm system in T. thermophilus. 2)Determine whether cell abnormality, nucleoid condensation and degradation, and cell death occur in the daughter cells which has lost the megaplasmid of the parABm gene deletion mutant. Thereby, simulate the process of the cell death triggered by parABm deletion in Thermus thermophilus. 3) Through in vivo and in vitro ParBm-parSm protein-DNA binding assay, determine the specific parSm DNA sequence of the parABSm system, and analyze the genetic organization and characteristics of this locus..To our knowledge, the characteristics and functions of parABS system in the megaplasmid of polyploid bacteria have only recently begun to be addressed. This work will provide further understanding of the genome segregation process in prokaryotes.

极端噬热菌Thermus thermophilus的大质粒为多拷贝，其表达有低拷贝质粒的分离基因位点同系物parABSm（包含parAm和parBm组成的操纵子，和一个DNA序列parSm）。.前期研究提示parABSm对维持大质粒的完整性有重要意义。本项目旨在：I）获得parABm敲除突变株，检验突变株的表型来分析parABSm的功能，如参与细胞形态维持、细胞分裂、大质粒的复制、最关键的是参与大质粒的子细胞分离过程。II）观察parABm突变株中缺失大质粒的子细胞的形态是否畸形、核DNA是否断裂，细胞是否死亡等，模拟出parABm的缺失导致子细胞死亡的过程。III）通过体内（in vivo）和体外（in vitro）的ParBm-parSm蛋白质-DNA结合实验，鉴定出parSm序列，分析parABSm位点的遗传构成与特性。.对多倍体大质粒parABS位点的研究尚少，本项目具有创新意义。

嗜热栖热菌Thermus thermophilus为研究极端嗜热微生物的模式物种，基因组含一个染色体和大质粒，均为多拷贝，大质粒表达有低拷贝质粒的分离基因位点同系物parABSm（包含parAm和parBm组成的操纵子，和一个DNA序列parSm）。本项目分析了该parABSm位点的遗传结构特征、功能及机制。.结果：1）遗传结构分析：通过体内（in vivo）和体外（in vitro）的ParBm-parSm蛋白质-DNA结合实验，明确了parABSm位点的遗传构成因素，鉴定出了ParBm特异性结合的parSm序列，其位于parBm基因内部，序列为5’-AAGGACGCGTCCTT-3’。2）通过敲除parABm操纵子伴随着突变体（ΔparABm::blm）的表现型观察分析parABSm的功能及其缺失导致子细胞死亡的机制：a)与野生株相比，ΔparABm::blm的菌落变极小、颜色变为白色且细胞生长严重受阻，提示parABm对维持细胞生长具有关键作用；b）ΔparABm::blm的部分细胞膨大（平均直径约为WT细胞的1.5倍），这些细胞的核DNA大多数（>80%）处于未分离状态、出现核DNA断裂的情况；c）PCR、PFGE及基因组重测序结果显示ΔparABm::blm缺失了160 kb的大质粒序列，残余大质粒约70 kb；d）qPCR及FISH分析结果显示残余大质粒可正常复制，但不能均匀分配到子细胞中，导致部分子细胞最终完全缺失大质粒；e）TUNEL实验对ΔparABm::blm的分析显示大部分（85%，统计100个细胞）膨大或DNA形态畸形的细胞为死细胞，该结果与毒素-抗毒素操纵子vapBC基因（位于大质粒上）敲除突变体（ΔvapBC）的TUNEL分析结果极为相似。 .结论：T. thermophilus中，大质粒上的parABSm位点对大质粒的子细胞定位与分离起着关键作用。parABm的缺失导致大质粒无法进行正确的子细胞分离，在细胞分裂过程中，压缩的大质粒可能无法完全解开，导致大质粒序列被扯断而丢失；而残余的大质粒复制后在细胞分裂过程中也无法进行精确分离，从而不能保证两个子细胞都分到同等数目的残余大质粒，致使部分子细胞完全丢失大质粒。大质粒的丢失意味着其上的多个毒素-抗毒素操纵子也丢失，这些子细胞中，毒素大量积累，从而引起基因组DNA断裂，最终细胞死亡。