根瘤菌NGR234的III型效应因子NopL和NopM的功能性分析

Biological nitrogen fixation, through symbiotic bacteria (rhizobia) in root nodules of legumes contributes a major and sustainable input into agriculture. Enhancing these systems through research will provide an environmental friendly and economical alternative to the increased application of nitrogen fertilizers. Hence, it is very important to understand the molecular mechanisms underlying beneficial interactions of legumes with nitrogen-fixing bacteria. Here, we propose research on two type 3 effector proteins (NopL and NopM), which are symbiotic determinants of the broad-host-range strain Rhizobium sp. NGR234. We plan to investigate the structural requirements for secretion and effector activity as well as subcellular localization of these type 3 effectors. Efforts will be made to identify and characterize plant proteins interacting with NopL and NopM. Attempts will also be made to elucidate the role of NopL phophorylation in eukaryotic cells and during nodulation. Furthermore, it is planned to analyze the nopM promoter and study effects of NopM within different plants. Finally, we will test whether NopM suppresses generation of reactive oxygen species during nodule initiation. The findings of this project will increase our knowledge on how rhizobia use type 3 effectors to manipulate plant cells to evade host defense. This project will contribute to the knowledge of how agronomically important rhizobia establish a nodule symbiosis with legume host plants.

根瘤菌在豆科植物根瘤进行的共生固氮，为可持续农业做出了重要的贡献。通过研究来促进这些共生系统的发展可提供一个对环境友好的氮肥应用的新途径。因此，在分子机制层面上对根瘤菌和豆科植物和之间相互作用关系的了解非常重要。本项目拟对广宿主根瘤菌NGR234的两个共生决定因子-III型效应因子蛋白NopL和NopM进行深入研究。将阐明NopL在共生过程中在真核细胞里的磷酸化作用，对NopM进行启动子分析和其在不同植物里的功能，是否干扰根瘤形成是的ROS反应等。同时将对这两个分泌到宿主细胞内的效应因子的细胞内定位，以及在共生中所起到的作用进行探索。对这个课题的研究将会使我们更进一步理解这些III型效应因子削弱植物宿主细胞防御反应并最后操控宿主细胞的机制。该课题将有利于更深入地了解根瘤菌和豆科植物之间进行结瘤共生的机理，为更广泛的根瘤固氮的农业应用提供理论依据。

根瘤菌在豆科植物根瘤进行的共生固氮，为可持续农业做出了重要的贡献。通过研究来促进这些共生系统的发展可提供一个对环境友好的氮肥应用的新途径。因此，在分子机制层面上对根瘤菌和豆科植物和之间相互作用关系的了解非常重要。.本课题通过构建NopL磷酸化突变体的衍生物发现，突变NopL中的十二个磷酸化位点可以使NopL丧失抑制酵母交配信息素信号途径这一能力，同时通过双分子荧光互补实验以及体外pull-down实验均证明了NopL与SIPK存在互作关系（磷酸化位点缺失突变体不具备互作功能）。同时在烟草中表达NopL，发现NopL可以抑制PR基因的表达，其磷酸化突变体相比之下这一能力大大减弱。最后，通过在菜豆上结瘤实验，发现NopL可以抑制根瘤早衰，磷酸化位点缺失突变体也丧失了抑制根瘤早衰的能力，揭示了在真核生物中磷酸化位点对NopL生化功能至关重要。.本课题通过NopM的亚细胞定位分析发现，NopM定位于植物细胞的细胞核和细胞质中。通过烟草叶片中表达NopM实验发现，具有E3泛素连接酶活性的NopM能够引起烟草叶片的HR。去磷酸化实验表明NopM在烟草表达时能够被磷酸化修饰，并证明了NopM的第26位丝氨酸在烟草中被磷酸化。进一步的体外磷酸化实验发现NopM能够被烟草的SIPK磷酸化。但NopM的磷酸化的生物学意义尚待探索。最后，通过体外泛素化实验发现NopM的E3泛素连接酶活性受到其富含亮氨酸重复序列的负调节，并且能被NopM泛素化的植物蛋白尚在探索中。NopM在烟草中表达能够抑制细菌鞭毛蛋白在烟草细胞中诱导的ROS反应。.同时将对这两个分泌到宿主细胞内的效应因子的细胞内定位，以及在共生中所起到的作用进行探索。对这个课题的研究将会使我们更进一步理解这些III 型效应因子削弱植物宿主细胞防御反应并最后操控宿主细胞的机制。该课题将有利于更深入地了解根瘤菌和豆科植物之间进行结瘤共生的机理，为更广泛的根瘤固氮的农业应用提供理论依据。