血浆长链非编码RNA作为缺血性脑卒中生物标记物的筛选及功能研究

Long non-coding RNAs (lncRNAs) have versatile functions and play critical roles in the occurrence and development of various diseases. Since plasma lncRNAs are found to be stable and have characteristic changes under disease conditions, they can serve as potential biomarkers for disease screening and diagnosis. However, few studies on the lncRNA biomarkers have been documented for ischemic stroke. In our preliminary study, the Arraystar lncRNA expression microarrays were employed to detect the lncRNA expression profiles in plasma among 20 pairs of ischemic stroke patients and sex-age matched controls. A total of 3861 lncRNAs were differentially expressed between case and control subjects. LncRNAs with large fold changes were tested by real-time PCR in the same plasma samples, and 10 lncRNAs were found to relate to ischemic stroke. On the basis of previous work, we plan to carry out two independent case-control studies to confirm the relationship between these plasma lncRNAs and ischemic stroke, and examine the potential of these plasma lncRNAs as ischemic stroke biomarkers. In addition, functional studies will be further performed to explore the effects of lncRNAs on the occurrence of ischemic stroke. Our study will not only provide useful information for exploring potential lncRNA biomarkers for ischemic stroke, but also shed light on the understanding of its underlying molecular basis.

长链非编码RNA（lncRNA）功能多样，与疾病发生发展密切相关。血浆lncRNA非常稳定，疾病状态下其表达谱会发生特征性的改变，具有作为疾病生物标记物的潜能。但目前未见缺血性脑卒中相关lncRNA生物标记物的研究报道。本研究前期采用lncRNA芯片对20对性别年龄匹配的缺血性脑卒中病例和正常对照的血浆lncRNA表达情况进行了初步分析，发现3861个lncRNA的表达水平存在显著差异；对部分差异倍数较大的lncRNA采用PCR复测，筛选出10个可能与缺血性脑卒中有关的lncRNA。我们拟在前期工作的基础上，采用两阶段病例对照研究，阐明血浆lncRNA表达水平与缺血性脑卒中的关联，寻找可作为缺血性脑卒中生物标记物的血浆lncRNA，并通过功能研究，探索lncRNA在缺血性脑卒中发生中的作用。本研究不仅可为缺血性脑卒中的筛查和诊断提供新的候选生物标记物，还可为揭示疾病的发病机制提供新线索。

长链非编码RNA（lncRNA）可能通过调控缺血性脑卒中相关基因的表达，在缺血性脑卒中的发生发展中发挥重要作用。血浆lncRNA表达水平变化可能与缺血性脑卒中的发生发展有一定联系，但目前有关血浆lncRNA作为缺血性脑卒中生物标记物的研究还较少。本研究前期采用lncRNA芯片对20对性别年龄匹配的缺血性脑卒中病例和正常对照的血浆lncRNA表达情况进行了检测，发现3861个lncRNA的表达水平在组间相差2倍以上（p<0.05）。根据芯片结果，选取10个在组间差异表达显著且表达水平较高的lncRNA，采用微滴式数字PCR进行两阶段人群验证。验证阶段I包括302对病例对照，验证阶段Ⅱ包括315对病例对照。在验证阶段I和Ⅱ中，lncRNA PITPNA-AS1、RNF5P1及NNT-AS1在病例组中的相对表达量均显著高于对照组（p<0.001）。将验证阶段的人群进行合并分析，校正其他危险因素后，高表达水平的PITPNA-AS1、RNF5P1及NNT-AS1与缺血性脑卒中发病风险增加有显著关联，OR（95% CI）分别为1.88（1.44，2.46）、3.24（2.36，4.44）及2.46（1.82，3.33）。采用Fisher判别分析构建lncRNA及lncRNA联合常规危险因素的判别模型，采用受试者工作特征曲线和重新分类的方法评估lncRNA作为缺血性脑卒中生物标记物的可行性。与只纳入常规危险因素的模型相比，加入PITPNA-AS1、RNF5P1及NNT-AS1能增加模型的曲线下面积（p<0.001），净重分类改善度为0.36（95% CI：0.25，0.47），综合区分改善度为0.19（95% CI：0.12，0.25）。结果表明血浆lncRNA PITPNA-AS1、RNF5P1及NNT-AS1表达水平与缺血性脑卒中发病风险有关，具有成为疾病生物标记物的潜能。在细胞实验中，lncRNA NNT-AS1表达水平升高可促进细胞增殖。通过芯片检测、生物信息学软件预测及细胞实验验证，发现lncRNA NNT-AS1可作为竞争性内源RNA，通过竞争性地结合miR-494-3p调控MACC1基因的表达，进而参与缺血性脑卒中的发生发展。本研究不仅可为缺血性脑卒中的筛查和诊断提供新的候选生物标记物，还可为揭示疾病的发病机制提供新线索。