基于链置换放大策略和临近表面杂交原理的电化学适配体传感器用于黄曲霉毒素B1检测的研究

Rapid and reliable detection of Mycotoxins including Aflatoxins, is an increasing need also for human. In order to resolve the issues of high cost，low sensibility, selectivity and throughout encountered with the rapid assay at present, we would screen aptamer against Aflotoxin B1 according to SELEX steps. Furthermore, with this aptamer we would construct aptasensor for the rapid and high sensitive detection of Aflotoxin B1 based on strand displacement amplification. This technique would be an alternative for developing portable and low-cost electrochemistry sensor with high sensitivity.

针对真菌毒素的快速、准确地检测一直是人们健康生活的迫切需求。为了解决当前黄曲霉毒素B1快检中所面临的灵敏度低、选择性差、检测成本高、检测通量低等问题，本项目拟采用SELEX技术筛选黄曲霉毒素B1的核酸适配体，在此基础上利用链置换扩增放大策略和临近表面杂交原理，开发电化学适配体传感技术并用于黄曲霉毒素B1的快速、超灵敏检测，为发展高灵敏、低成本的便携式新型电化学真菌毒素传感器提供技术支撑。

黄曲霉毒素B1（AFB1）是自然界中毒性最强的一种真菌毒素。常规的AFB1仪器检测方法灵敏度高、选择性好，但是不能满足现场快速筛查分析的需要，因此开发高效的AFB1快速筛查技术显得非常迫切。目前主流的依赖抗体的AFB1快检技术层出不穷，但是在准确度和灵敏度方面依然有待进一步提高。随着高特异性新型分子识别元件——核酸适配体的出现以及相应的筛选技术（SELEX技术）的逐渐成熟，开发基于核酸适配体的高灵敏、高特异性AFB1检测新方法成为可能。.本项目针对AFB1采取自由态靶标筛选策略筛选核酸适配体。研究中所使用的单链DNA文库由5部分构成：两端序列为引物扩增序列（碱基序列已知），中间为固定序列（往磁珠上固定文库，序列预先设计好），两端引物序列与中间固定序列之间各有一段随机序列，具体设计为：5’-CCTGCCACGCTCCGCAAGCTT-N10-CTGCAGCGATTCTTGATCG-N20-TAA GCTTGGCACCCGCATCGT-3’。经过十几轮的严格筛选，获得初级核酸适配体序列，随后对其进行二级结构分析并采用计算机突变进化法和PCR突变进化法对该序列进行序列优化，最终得到序列较短的最佳AFB1核酸适配体序列：5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTG TCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3’，Kd = 20 nM。为了开发基于链置换放大策略和临近表面杂交原理的AFB1电化学适配体传感器，需要筛选与AFB1最佳核酸适配体序列相应的链置换探针（5’-ACACGTGCCCAACAATCTGGT-3’，既能与AFB1核酸适配体杂交形成杂交复合物，同时又不影响AFB1与核酸适配体的结合，即当AFB1与核酸适配体结合时能够被轻松置换下来）。在获得最佳链置换探针的基础上，我们开发了基于核酸适配体的AFB1电化学方法用于玉米中AFB1的检测，该方法是一种signal-on检测模式，动态检测范围为0.1 pM~10 nM，检测限为0.1 pM（3倍空白信号）。通过特异性实验及与传统ELISA方法的对比，结果证明该方法特异性好、灵敏度高、准确可靠，有望为AFB1的超灵敏检测以及其他真菌毒素的检测提供了一种技术选择。项目执行过程中共发表论文6篇，申请专利6项，授权专利2项，开发基于丝网印刷电极的便携式电化学速测仪样机1台。