应用蛋白质组学技术筛选硫化氢中毒生物标识物的探索研究

Judgment and clinical diagnosis of the hydrogen sulfide poisoning is always persecuting the scientists in forensic science and clinical science. Hydrogen sulfide is considered a broad-spectrum, meaning that it can poison several different systems in the body. On the other hand, recent experimental studies reveal that hydrogen sulfide could be also produced enzymatically at micromolar levels in mammals and exerts a number of physiological actions in the cardiovascular system which indicates the human body should have a number of proteins related to immunological response of hydrogen sulfide poisoning. That means the hydrogen sulfide poisoning would induce an obvious change in protein expression level in human body, especially in blood. Proteomics is the newly developed techniques to analyze the whole proteome of a tissue, organism or body fluid based mass spectrometry in recent decades. It has changed the way proteins are analyzed in living systems. This approach has been applied to blood and related blood products for protein profiling to look for many kinds of biomarkers. After one decade development, the approach for blood proteomics is well established and it should be considerably suitable for forensic science and clinical science research. Here, we will establish an animal model using rats for hydrogen sulfide poisoning experiments. We will design the different degree of intoxication and take the blood sample for each level. Combining the technology of two-dimensional gel electrophoresis, isotope labeling quantitative technique, label free quantitative technique and two-dimensional liquid chromatography coupling with mass spectrometry, we are hoping to systematically study the whole blood proteome of hydrogen sulfide poisoning to look for the potential biomarkers which could help the judgment and clinical diagnosis of the hydrogen sulfide poisoning. Moreover, we would validate those potential biomarkers using western blot techniques once we could find them. Based on those potential biomarkers, we expect that we could finally establish the efficient strategy for hydrogen sulfide poisoning judgment and clinical diagnosis in forensic science and clinical science.

硫化氢中毒程度的诊断与检测一直是法医学及临床医学的难题。硫化氢中毒随着中毒程度的变化会有不同的致死机理，同时内源性硫化氢作为信号转导分子参与多种与心血管相关的机能,揭示通过蛋白表达层次的研究寻找硫化氢中毒的生物标识物分子的可能。近年来，基于生物质谱的蛋白质组学技术发展迅速，为法医学及临床医学提供了崭新的研究思路与手段，而蛋白质组学技术也被广泛用于寻找各种生物标识物。本课题拟通过大鼠模型，采集不同程度硫化氢中毒的血液标本，采用双向凝胶电泳技术、同位素标记定量技术以及非标记定量技术结合二维色谱－质谱联用鉴定的技术路线系统研究硫化氢中毒前后血液样本中的蛋白质表达变化，进而寻找硫化氢中毒相关生物标识物。同时通过蛋白质印迹试验针对可能的蛋白质标识物进行生物学验证,期望能够获得可以在法医学及临床医学实践中实际应用的技术手段。

硫化氢是无色剧毒气体，硫化氢中毒是一种常见的职业中毒事故。硫化氢中毒主要由吸入引起，中毒机理和靶器官根据接触浓度和接触时间而异。急性硫化氢中毒主要表现为神经系统、呼吸系统和心肌等器官及组织损害，其中毒机理是赖以进行法医学死因鉴定及临床医疗救治的基础，但至今尚未阐明。由于组织细胞缺氧是急性硫化氢中毒的原因之一，而血液是氧气输运的主要媒介，血液可作为毒理分析的重要依据，对血液的蛋白质组学研究能直接反应中毒过程中的蛋白质表达变化，为寻找中毒生物标识物提供线索。由此，本课题采用大鼠硫化氢中毒模型，结合实际情况，设计低剂量模拟中毒实验，大鼠暴露于150 mg/m3 浓度受控的硫化氢环境中，分别刺激0小时、2小时和4小时。收集大鼠血液后，分离血浆并去除高丰度蛋白，通过串联质谱标签标记技术和二维液相色谱-串联质谱进行血液蛋白质组学研究。实验采取两组平行重复以确认鉴定及定量结果。质谱数据采用Proteome Discoverer软件以及MASCOT软件在数据库Rat UniProtKB/Swiss-Prot进行分析，统计学软件Scaffold以及MATLAB被用于进行质量控制以及数据的聚类分析。而数据的生物信息学分析则通过网站Entrez Gene与DAVID，进行GO与KEGG分析。在两次重复实验中，具有定量信息的特征蛋白一共鉴定到643个，其中424个蛋白具有显著差异。这些蛋白中，有88个蛋白是2小时组独有，134个蛋白是4小时组独有，同时还有202个蛋白两个组都鉴定到了。另外，在2小时与4小时组中一共发现173个上调蛋白与15个下调蛋白。这鉴定到的290个蛋白（2小时组）和336个蛋白（4小时组）分别涉及了16和19个生物学过程，包括了蛋白定位，细胞合成，物质反应，细胞黏附，凋亡，细胞生长，氧化还原等。此外，这些鉴定到的2小时组蛋白和4小时组蛋白分别对应了11和10条KEGG信号通路，包括了核糖体，蛋白酶体，粘着斑，紧密连接，肌动蛋白细胞骨架调节等。大量的生物信息学分析表明，这些蛋白均有潜力成为硫化氢中毒的生物标识物，并用于临床诊断与法医学鉴定。本课题首次在毒理学研究中应用血液蛋白质组学技术，该技术不仅在硫化氢中毒机制及代谢机理上有所突破，筛选出众多潜在的生物标识物，也逐步为其他毒理学研究搭建成熟的技术平台，在现代法医学研究中谋求原有局限与框架的突破，具有重大的意义。