利用荧光示踪技术研究制革过程中蛋白酶的传质特性

Application of proteases for replacement of polluting chemicals used in traditional leather processing and improvement of production efficiency is one of the most important trends in leather industry. However, the mechanism of mass transfer and action of proteases in leather processing remains unclear due to the lack of an appropriate method of effectively observing the transfer of enzymes in animal skin/hide, which has severely restricted the wide use of proteases in leather industry. In this project, typical proteases used in soaking, unhairing and bating processes will be labeled by fluorescein. The fluorescence-labeled proteases with both high fluorescence intensity and high biological activity could be prepared by optimizing the conditions of labeling and purification. Then the treatment of skins/hides will be conducted using the fluorescence-labeled proteases, and the transfer and distribution of the proteases in skin/hide will be observed accurately using fluorescence tracking during soaking, unhairing and bating processes. The effects of structure of skin/hide matrix and chemical pretreatment on the transfer of the proteases will be investigated. In addition, the relationship between the transfer of proteases and the soaking, unhairing or bating effectiveness will be elucidated. As a result, the regularities of mass transfer of the proteases in skin/hide during these processes, as well as their effects on enzymatic reaction and quality of leather products will be revealed. These results will provide fundamental data to the enhancement of mass transfer of proteases and the development of cleaner leather production.

利用蛋白酶替代传统制革过程使用的污染性化学品并提高生产效率是制革工业最重要的发展方向之一。但由于缺乏适当的方法来准确观测酶分子在动物皮内的传质现象，制革过程蛋白酶的传质和作用机理尚不明确，极大地制约了蛋白酶在制革工业中的广泛应用。本项目拟对制革浸水、脱毛和软化工序常用的蛋白酶实施荧光标记，通过优化标记及纯化条件，获得荧光强度和生物活性均较高的荧光蛋白酶。然后用其处理动物皮，利用荧光示踪技术准确观测浸水、脱毛和软化过程中蛋白酶在皮内的传递和分布情况。系统研究皮的组织结构特点和预处理程度对酶传质过程的影响，并结合浸水、脱毛和软化效果，阐释蛋白酶的传质规律及其对酶促反应和皮革产品质量的影响，从而为强化制革过程蛋白酶的传质提供基础数据，并为推进清洁、高效制革过程技术的发展提供理论指导。

用蛋白酶替代传统制革化学品是皮革工业实现清洁生产和提高生产效率的重要方向，但由于缺乏观测皮内酶分子的方法，制革过程酶的传质和作用机理尚不明确，这极大地限制了基于蛋白酶的制革生物技术的有效开发和推广应用。本项目首先制备了荧光强度较高且催化活性保持良好的高纯度荧光胰蛋白酶，然后用其对牛皮进行酶助浸水、酶脱毛和软化处理，再结合荧光显微技术实现了酶在皮内的准确定位及其分布的半定量分析，探明了制革过程蛋白酶的传质行为以及酶的相对分子质量、皮的组织结构、制革工艺条件等对其传质行为的影响。结果表明，浸水和脱毛过程中，由于牛皮厚度大、粒面附有表皮和毛、皮胶原纤维未分散，蛋白酶不能渗透牛皮，酶的相对分子质量对其在皮内的传质影响很小。需要指出的是，在酶脱毛过程中即使绝大部分的牛毛都脱落了，蛋白酶也仍然不能渗透牛皮。该现象证明了只有从粒面方向渗入毛囊和毛根连接处的蛋白酶才能产生脱毛效果，同时阐释了酶脱毛易引起粒面损伤或松面的主要原因是蛋白酶滞留在粒面层中的时间长于网状层，从而导致粒面层的胶原纤维被水解破坏得更多。软化过程中，由于牛皮变薄、表皮和毛去除彻底、胶原纤维分散良好，蛋白酶较易渗入裸皮，且相对分子质量较小的蛋白酶明显渗透得更快，选用相对分子质量较小的蛋白酶对均匀软化具有重要意义。上述结果还表明了与酶的相对分子质量相比，皮的厚度、表皮和毛、胶原纤维的分散程度等对制革过程蛋白酶传质的影响更大。此外，升高温度、减小液比、增加酶用量和添加渗透剂均能增加蛋白酶在皮内的传递速率，提高脱毛/软化效率；特别地，合理使用渗透剂既能强化蛋白酶传质，又能减少皮胶原的损伤，是提高酶对毛皮/裸皮水解均匀程度、保证皮革品质的有效措施。项目建立的皮内酶示踪技术为深入研究制革过程酶的传质及作用机理奠定了良好的基础，研究结果为强化制革过程蛋白酶的传质提供了基础数据，同时为推进制革清洁、高效生产技术的开发提供了理论指导。