蓝藻砷糖合成的分子机制研究

Arsenic is a toxic element ubiquitously encountered in the environment. Organoarsenic compounds are generally less toxic than inorganic arsenic. To date, studies on arsenic biotransformation mechanisms have mainly focused on arsenate reduction, arsenite oxidization, or arsenic methylation. However, little is known about the pathway of converting arsenic into complex organoarsenic. Arsenosugars play a pivotal role in the arsenic biogeochemical cycle. There has been no breakthrough on the research of arsenosugar synthesis mechanism since the mechanism was proposed in 1987. Our previous study showed that three genes, arsM, slr0304, slr0305 of arsM operon from Synechocystis sp. PCC 6803 may be involved in arsenosugar biotransformation. In this project, the mechanism of arsenosugar biosynthesis of Synechocystis sp. PCC 6803 will be explored. The three genes will be disrupted, and complementary mutants will be conducted subsequently in order to identify the function of the genes in arsenosugar biosynthesis. To verify the function of these genes, the genes will be expressed in E. coli respectively, and arsenic species will be determined after the cells are treated with arsenic. In the end, intermediate products of arsenosugar biosythesis will be purified and identified. The pathway of arsenosugar biosynthesis will be proposed according to the above results. In conclusion, our research will enhance understanding for the molecular mechanism of organoarsenic biotransformation, and provide scientific evidence to application of alga in remediation of arsenic contaminated water and soils.

砷是一种广泛存在于环境中的有毒元素，与无机砷相比有机砷是相对低毒的。到目前为止，对砷生物转化机制的研究主要集中于五价砷的还原，三价砷的氧化以及砷的甲基化，而对复杂有机砷的形成过程少有探讨。砷糖在砷的生物地球化学循环中起着关键作用，但对砷糖合成机制的研究自从1987年到现在一直没有突破，停留于假说状态。我们前期的研究表明集胞藻arsM操纵子上的三个基因：arsM, slr0304, slr0305可能参与了砷糖合成。本项目拟围绕模式生物集胞藻的砷糖合成分子机制展开研究。分别敲除集胞藻arsM操纵子上的三个基因并构建其互补突变体，探索三个基因在砷糖合成中的作用；在大肠杆菌中分别表达此三个基因，测其对砷的转化能力，验证所克隆基因的功能；分离纯化砷糖合成的中间产物，鉴定其化学结构，并推测砷糖的生物合成途径。总之本研究将加深对有机砷生物转化分子机制的理解，为土壤和水体砷污染的生物修复提供科学依据。

砷是一种剧毒物质，在地壳、土壤、水域及大气中广泛存在。长期的砷接触与皮肤癌、肺癌的发生有明显相关性，并与肝癌、膀胱癌和肾癌等多种内脏癌的发生密切相关。海产品是人类砷暴露的主要来源，并且因为生物对五价砷的吸收是通过其磷酸转运蛋白而海水中低磷含量使海洋生物比其陆生同类更易吸收和积累砷。幸好，海产品中毒性高的无机砷含量较低，毒性低或毒性没有定论的有机砷是砷存在的主要形式。例如被认为几乎无毒的砷化合物砷甜菜碱是海虾中砷的主要存在形式，海藻和海洋鱼类中含有种类繁多的砷糖磷脂，海藻样品（包括紫菜，海带，鹿角菜，裙带菜，羊栖菜等）中砷糖含量较高。砷糖是一种含脱氧核糖的复杂有机砷，其直接毒性并无定论，但可以确定砷糖是砷生物地球化学循环中的重要化合物，Edmonds等认为砷糖是砷解毒过程的中间副产物，砷甜菜碱的合成起始于砷糖的降解；另外从化学结构上看砷糖磷脂的合成也可能从砷糖开始。然而长期以来国内外对砷的研究主要集中在无机砷的生态毒理、有机砷的形态分析、植物对无机砷的吸收积累等。近年来随着分子生物学的迅速发展，人们开始关注环境中砷的生物转化及其分子机制，但所有的研究工作都集中在砷的氧化还原及甲基化去甲基化，对环境中广泛存在的更复杂的砷有机物生物转化分子机制的研究几乎是空白。在项目中我们基于模式生物蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803能将毒性较强的三价砷转化成砷糖和砷糖磷脂的研究。首先将ars操纵子上三个可能参与砷糖合成的基因（slr0303, slr0304, slr0305）敲除，用不同形态砷处理突变体HPLC-ICP-MS分析细胞及培养基中砷形态变化，发现三价砷处理的slr0303和slr0304突变体不能合成砷糖；进一步在大肠杆菌中异位表达slr0303和/或slr0304，利用HPLC-ICP-MS/ESI-MS-MS和HPLC-ESI-HR-MS-MS技术分析三价砷处理的大肠杆菌细胞及培养基中砷转化，结果表明共同表达slr0303和slr0304的大肠杆菌将无机的三价砷转化成DMA和多种含羟基羧酸的二甲基砷。本研究为研究复杂有机砷的生物合成机制及生物地球化学循环提供了新的视角，也为海产品中复杂有机砷的起源和生态功能以及海产品人体砷暴露风险研究提供了重要理论基础。