SGK3缺失介导Ezrin泛素化在慢性肾病中的作用及机理研究

SGK3 is the protein kinase of E3 ubiquitin ligase Nedd4-2, which mediates Ezrin ubiquitination. Down-regulation of Ezrin leads to the increase of phosphaturia and podocyte damage.The expression of SGK3 is decreased in chronic kidney diseases (CKD). However, little is known about the detail molecular mechanism of SGK3 deficiency on Ezrin ubiquitination and its role in phosphorus disturbance and proteinuria of CKD. Previously we have found that lacking of SGK3 leads to increased Ezrin ubiquitination and degradation, decreased sodium-phosphate cotransporter iia (Npt2a) level, as well as fusion of podocytes foot processes. Current project aims at: 1. Investigating the effect of SGK3 deficiency on Ezrin ubiquitination and the interaction of Ezrin and Nedd4-2, to clarify the molecular mechanism of Ezrin degradation mediated by SGK3 deficiency; 2. Knocking down SGK3, synthesizing small peptides to intervene the combination of Nedd4-2 and Ezrin in vitro and in vivo, analyzing the influence of Ezrin ubiquitination on the turnover of Ezrin/Npt2a and Ezrin/ podocalyxin complex, the urinary excretion of poshphate and protein, thus to explore the molecular mechanism of increased phosphaturia and proteinuria in CKD. The expecting results will provide new clues to the CKD pathogenesis and provide molecular drug targets for prevention and therapy of CKD.

Ezrin下调致尿磷增加及足细胞损伤，且影响Ezrin泛素化的Nedd4-2上游激酶SGK3在慢性肾病（CKD）小鼠肾内缺失，然而，SGK3缺失介导Ezrin泛素化在CKD中磷代谢紊乱和蛋白尿发生的分子机制不明。我们发现：沉默SGK3致Ezrin泛素化和降解增加，Na-P协同转运子2a(Npt2a)水平降低及足突融合。本项目拟：1.探讨SGK3对泛素连接酶Nedd4-2与Ezrin的相互关系以及对Ezrin泛素化的影响，阐明SGK3下调时Ezrin降解的分子机制；2.在细胞和整体水平下调SGK3以及设计阻遏Ezrin与Nedd4-2结合的肽段干预，探讨Ezrin泛素化对Ezrin/Npt2a及Ezrin/足糖萼蛋白（足细胞标志蛋白）复合物命运转归、分布、活性及尿磷、尿蛋白的影响，阐明CKD中肾小管排磷增加与蛋白尿发生的分子机制。本研究结果将为CKD发病机制提供新线索并为其防治提供分子药靶。

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3（Serum and glucocorticoid-inducible kinase 3，SGK3）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SGK家族的一员，在细胞生长、增殖和迁移中均发挥着重要作用，但迄今为止，有关SGK3在肾脏足细胞及肾小管上皮细胞钠磷转运（Npt2a）中的作用鲜有报道。本研究通过构建阿霉素肾炎小鼠以及SGK3基因敲击鼠模型，并使用SGK3、Nedd4-2、GSK3β等质粒及慢病毒转染鼠体外培养的足细胞、HEK293T细胞及负鼠肾小管上皮细胞，分别采用RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学以及免疫共沉淀技术，来研究SGK3的下游靶蛋白Nedd4-2以及GSK3β对足细胞功能以及Npt2a的调节作用。结果发现SGK3基因敲击小鼠蛋白尿增加，SGK3/GSK3β信号通路参与调节足细胞活力、裂孔膜蛋白podocin的表达以及Npt2a的表达与活性；SGK3/Nedd4-2参与调节Npt2a的表达与活性，并且此信号通路介导的Ezrin参与调节足细胞Ezrin/PC复合物的稳定性。此外，本研究首次证明了Nedd4-2与骨架蛋白Ezrin存在相互作用，但SGK3/Nedd4-2信号通路调节足细胞而非肾小管上皮细胞Ezrin的泛素化。本研究结果进一步解读了SGK3在慢性肾脏病（CKD）中的多元化作用，拓展了人们对CKD蛋白尿与磷代谢异常一体化调控机制的认识，并为有效防止CKD进程提供了新的分子靶点。