拟南芥中与同源依赖性基因沉默相关的新基因的功能研究

表观遗传过程对基因组完整性及其表达调控起重要作用。现已在植物中发现了多条同源依赖性基因沉默（HDGS）途径，但对其机理及参与因子的了解并不十分清楚。本课题旨在克隆已定位于拟南芥基因组中的三个新基因并研究其在HDGS中的功能。我们已将与HDGS相关的三个遗传修饰基因精确定位于拟南芥5号染色体的一个区域内，此区域不包含任何已知的与基因沉默相关的基因。P10和P35是非等位隐性修饰基因，调控C-插入转基因查尔酮合酶（CHS）的同源依赖性基因沉默（HDGS）。R4-1是同源依赖性基因沉默的显性修饰基因。本课题将克隆P10、P35和R4-1基因，结合分子生物学、遗传学和生物化学，对其中一个基因的功能进行详细研究。分析该基因在不同沉默途径中的功能，应用酵母双杂交技术筛选与其蛋白质产物互作的蛋白。对这些新基因的发现和功能研究，将有助于我们更好的了解植物中的HDGS途径。

本项目的目的是利用三个拟南芥突变系鉴定与同源依赖性基因沉默（HDGS）缺陷相关的基因，并研究其中一个基因的功能。三个拟南芥突变系是利用EMS诱变一个在第三染色体上含有多个T-DNA（C-insert）串联插入的拟南芥稳定突变系获得的， T-DNA的插入导致CHS基因沉默。三个DHGS的突变系的突变位点初步定位在第五染色体顶臂的一个区域内。但是精细定位却一直没有进展。我们实验证明C-insert位于第五染色体上而不是第三染色体上。经Sounthern杂交证实突变体中的C-insert没有发生结构变化。为了实现精细定位，我们利用一个携带有沉默的gus报告基因的DHGS系L5与三个突变体进行杂交。然而gus基因的沉默不稳定，所以获得的作图群体不可用。为了尽量克服这些困难，我们双管齐下。一是，我们锁定了三个突变系定位在第五染色体上的274kb区域，筛选了30个可能与HDGS有关的候选基因进行鉴定。至今，已经对其中两个突变体的候选基因进行了测序，但是未发现任何突变基因。二是，获得另一批五个HDGS突变系（C-插入），并对其进行定位。初步定位发现五个突变系的突变位点仍位于第5号染色体上，与第一批突变体定位于同一区域上。Southern杂交分析表明，其中三个突变体中C-insert已经发生改变了，只有在第5个突变体中的C-insert的结构没有发生变化。.EMS诱导突变几乎只发生点突变，因此几个突变系的突变区域集中于同一区域，并且其中几个突变体的C-insert发生了改变，这是出人意料的也是非常有趣的。几个突变系中HDGS缺陷的消失被认为是C-insert的结构改变引起的。至于其他HDGS突变系，鉴定突变位点的工作仍在继续。然而，不排除其他几个突变系中的HDGS缺陷是由于C-insert结构的微小变化引起的。C-insert结构的改变可能是是由于除EMS诱变剂本身以外的其他方面引起的。