胃癌血管靶向性噬菌体呈现肽的筛选及鉴定

肿瘤血管靶向性治疗在现代肿瘤的综合治疗中具有划时代的意义，然而目前的血管靶向性治疗药物特异性不高、毒副作用较大，限制了其临床应用。目前国内外在胃癌血管靶向治疗方面尚未找到能与胃癌血管特异性结合的"肿瘤血管特异性靶分子"。我们前期利用噬菌体肽库体内筛选法，率先获得了能在胃癌血管富集的环九肽CGNSNPKSC，然而它与正常血管也存在一定的非特异性结合能力，靶向性不足。本项目拟利用噬菌体肽库技术，联合采用荷瘤裸鼠体内阳性筛选与正常血管体外阴性消减筛选策略，通过多轮筛选、控制筛选强度及产率，获得与胃癌血管高特异性结合的靶向肽。并通过DNA测序、生物信息学分析、免疫组化、免疫荧光等方法鉴定其靶向性。本项目将为胃癌血管靶向性治疗提供"特异性靶分子"，对提高胃癌血管靶向性治疗疗效、降低毒副作用具有重要意义。

本课题旨在探索胃癌血管靶向治疗领域中的胃癌血管特异性靶标。我们首先获取了新鲜人胃腺癌组织，采用RSCA法建立了裸鼠肾包膜下胃癌移植瘤模型。将移植瘤取下通过CD34及VIII因子染色进行血管密度鉴定，结果显示移植瘤具有较丰富的微血管组织，可用于后续体内噬箘体肽库筛选的阳性平台。同时我们购进了正常人脐静脉内皮细胞HUVEC和正常人微血管内皮细胞MUVEC，微管形成实验显示其内皮细胞表型明显，可用于后续体外阴性削减筛选平台。我们购进了噬菌体呈现环七肽库，首次经过3轮荷瘤裸鼠体内阳性筛选联合正常血管内皮细胞体外阴性消减筛选，挑选其中能富集于胃癌血管而与正常血管内皮无明显结合的噬菌体克隆，获得103个候选克隆。将其一一测序、翻译并比照氨基酸排列顺序重复率，我们获得了19条重复率最高的胃癌血管靶向性噬菌体呈现肽。选取其中一条短肽进行生物合成，免疫荧光实验显示：该短肽能特异性结合于人胃癌血管内皮，而与正常血管内皮无明显结合。证实我们改进的体内外联合噬菌体呈现肽库筛选策略是有效、可行的。此外我们首次对短肽GX1进行了生物学功能分析，MTT实验显示该短肽具有一定的抑制胃癌血管内皮细胞增殖的作用。流式细胞学分析显示，该短肽作用后的靶细胞凋亡率明显提高。进一步通过基因芯片分析显示该短肽可诱导三百余个基因显著差异表达，其中上调二百余个，下调一百余个。根据GO分类结果，显著差异表达的基因主要与肿瘤生长、侵袭、转移相关。蛋白印记验证发现短肽作用后靶细胞中Bcl－2表达下调，Bax及Caspase3表达上调，Caspase8表达无明显变化，首次证实该短肽可能通过下调Bcl-2/Bax的比值，激活Caspase3，进而通过线粒体途径诱导细胞凋亡实现对靶细胞的抑制作用。本实验的结果，为后续进一步开展候选肽的相关研究奠定了基础，为寻找胃癌血管靶向性分子提供新的筛选策略，并为胃癌血管靶向性诊断及治疗提供新的靶分子，对于提高胃癌治疗的疗效及安全性具有重要意义。