cGMP参与环核苷酸门控通道（CNG）缺陷所致遗传性视网膜椎体发育异常

The hereditary cone diseases, including achromatopsia, are very common and ophthalmology difficult, and one kind of congenital disorders in China. They are presumably caused by mutations of genes in visual pathway. Photoreceptor cyclic nucleotide-gated (CNG) channels play a pivotal role in phototransduction, and mutations in the cone CNG channel are associated with achromatopsia, progressive cone dystrophy and early-onset macular degeneration. Nevertheless, little is known about the molecular mechanism of retinal pathogenesis resulting from CNG channels deficiency. And there views about working mechanisms on this particular channel are still unavailable in China. The study will determine the cone pathogenesis resulting from CNG channel deficiency. Specifically, we will establish the role of cGMP in vivo and determine the mechanism of cone degeneration. We will perform these studies using the newly developed mouse line: CNGB3-/- mice and developing new double knockdown mouse line: CNGB3-/-/GC1-/-mice. Using these mouse model, we will determine the role of the cGMP pathways in by using specific inhibitors, RNAi knockdown technology. The techniques involved in this proposal are well-established in the laboratory or will be performed in collaboration with an identified expert. Upon completion of this study we will have a better understanding of the pathogenesis resulting from CNG channel deficiency. These studies will provide the knowledge base to understand cone diseases, help identify the therapeutic targets to reduce cone death and prolong the life span of cones and improve the quality of the population.

预防出生缺陷是提高我国人口质量的重要内容。色觉异常遗传性疾病是我国常见出生缺陷疾病之一。普遍认为是视觉传导通路中一些基因的重组或点突变导致。现已发现环核苷酸门控（CNG）通道在该类疾病中发挥了重要作用，但是目前对其发病的分子机制了解还非常有限。国内在相关方面也尚未开展研究。本项目拟从分子水平上针对色觉异常遗传性疾病的发病机制和修复机制进行研究和探索。利用CNGB3缺陷小鼠模型，通过特异性抑制剂，siRNA靶基因沉默和建立双基因缺陷小鼠(CNGB3-/-/GC1-/-)方法，从体内，体外下调cGMP水平，研究CNGB3缺陷导致的视锥体变性退化与cGMP信号传导途径的关系，探讨视锥细胞退行性变的分子机制，为该疾病的早期治疗提供生物学理论基础，达到对出生缺陷进行有效干预目的。同时为深入了解CNG通道功能及其对人类疾病的作用提供理论线索，对提高人口质量具有良好的科学意义。

全色盲是一种严重的常染色体隐性遗传病和出生缺陷疾病之一。在西方国家的发病率约为1/30 000，以视锥细胞功能缺失、全色盲、视力严重障碍、畏光、眼球震颤等为特征。目前已报道了5个全色盲相关基因，分别是CNGA3、CNGB3、GNAT2、PDE6C和PDE6H，均在视锥细胞中表达，其中约25%的全色盲源于CNGA3突变，40%～50%源于CNGB3突变。因此，该项目研究具有重要科学意义及应用价值。.本项目中我们利用CNGB3缺陷细胞模型，通过特异性抑制剂（ODQ），结合在双基因缺陷小鼠的研究，通过下调细胞内cGMP水平，研究CNGB3缺陷导致的视视锥变性退化与cGMP信号传导途径的关系。CNGB3基因过表达对WERI-Rb-1细胞内cGMP水平变化的影响与椎体细胞功能关系的研究，发现CNGB3缺陷可以导致细胞内cGMP水平升高，高水平的cGMP可能会导致视锥细胞功能受到损伤。该研究国内外未见报道。我们使用梯度浓度ODQ作用于WERI-Rb-1细胞，发现3μM ODQ作用下细胞内cGMP水平开始下降，视锥感光器特异性基因M-opsin，S-opsin，GNAT2，CAR表达量均升高，细胞凋亡开始减少；9μM浓度作用时cGMP下降了约21.3%，达到极值，M-opsin，S-opsin的表达量下降到几乎与对照组持平，GNAT2，CAR的表达量甚至低于对照组，细胞凋亡升高；同时细胞外cGMP水平没有明显变化。在双基因纯合性缺失小鼠模型中，发现视网膜cGMP浓度明显低于CNG通道缺失小鼠，视锥细胞的存活状态得到改善恢复。通过腹腔注射ODQ，发现CNGB3-/-小鼠视网膜中cGMP水平下降，M-opsin，S-opsin蛋白表达增加。.我们的研究结果表明，CNG通道缺陷所致的cGMP蓄积可以对视锥细胞产生细胞毒作用，cGMP可能是导致视锥细胞死亡的触发或加速器。cGMP信号传导途径与视锥细胞变性退化具有关联性：下调视网膜细胞中cGMP水平后，视锥细胞特异性基因及蛋白表达水平有所升高，细胞凋亡程度有下降趋势。但细胞内cGMP水平的降低与视锥细胞功能恢复并不是必然和线性关联，可能存在有独立于cGMP的机制参与其中。我们的研究为后续工作奠定了基础，为遗传性视网膜疾病中视锥细胞的退化机制提供了新的认知，为后续该疾病的干预治疗研究奠定了一定的基础。