UTMD"可逆开闭"血视网膜屏障联合rAAV-MERTK治疗视网膜色素变性的实验研究

Blood-retina barrier(BRB),is regarded as the main reason that impedes genes entering the retina. To conquer BRB is a challenging task, there is no safe and effective way found up to now. Ultrasound targeted microbubble destruction (UTMD), provides possibility for conquering BRB. UTMD can make a transient core on the cell membrane or among the cells, thus urge the genes to enter tissue and cells. Our previous experiment proved that UTMD could be used safely to enhance rAAV2-EGFP(type 2 recombinant adeno-associated viral vectors encoding enhanced green fluorescent protein)transfection efficiency of rat retina. This project assumes that UTMD can target the reversible opening and closing BRB under compatible conditions, search for the mechanism of the reversible opening and closing BRB as well as its effects on the visual function, and explore the new method of the transportation of the retina genes. Based on this way, we use rAAV-MERTK to infect Royal College of Surgeons (RCS), so as to evaluate the therapeutic effects of the UTMD combined rAAV-MERTK on retinitis pigmentosa. If it can solve the tough problem of the gene delivery blocked by BRB, it will provide the gene therapy of retinal diseases with a convenient, safe and effective transfection system.

血视网膜屏障(blood-retina barrier, BRB)被认为是阻碍基因进入视网膜的主要原因。克服BRB输送基因是一项具有挑战性的工作，至今尚无有效的方法。超声靶向破坏微泡（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）为克服BRB提供了可能。UTMD可在细胞间或细胞膜上产生一过性的空隙，促使基因进入组织和细胞。我们前期实验证实UTMD能够有效提高rAAV2-EGFP转染视网膜的效率。本研究设想在适合的条件下UTMD能够靶向"可逆开闭"BRB，探寻"可逆开闭"的机制及其对视功能的影响，探索视网膜基因输送的新方法。借此方法用rAAV-MERTK转染皇家科学院大鼠，考察UTMD联合rAAV-MERTK 对视网膜色素变性的治疗效果。如果能够有效解决BRB阻碍基因输送的难题，将为视网膜疾病基因治疗提供方便、安全、有效的输送系统。

背景：.视网膜疾病是成人首要的致盲疾病，许多视网膜疾病尚无有效的治疗方法，基因治疗为难治性视网膜疾病带来了希望。血视网膜屏障（BRB）被认为是阻碍基因进入视网膜的主要原因。克服BRB输送基因是一项具有挑战性的工作，至今尚无有效的方法。超声靶向破坏微泡（UTMD）可在细胞间或细胞膜上产生一过性的空隙，促使基因进入组织和细胞，为克服BRB提供了可能。.主要研究内容：.本课题拟通过玻璃体腔注射超声造影剂并联合超声辐照的方法，探讨UTMD是否能够“可逆开闭”BRB屏障；探索“可逆开闭”的机制，搭建视网膜基因转染新的技术平台。借助此平台用rAAV-MERTK基因转染皇家科学院 RCS 大鼠，考察UTMD联合rAAV-MERTK 对视网膜色素变性的治疗效果。.重要结果、关键数据：.（1）对于视网膜色素上皮（RPE）细胞安全范围的UTMD实验条件。辐照强度小于等于2w/cm2、时间为1min、占空比小于等于50%的脉冲波、造影剂浓度小于50%时细胞的生存率在80%以上。.（2）体外证明UTMD技术能够“可逆开闭”血视网膜屏障，摸索“可逆开闭”屏障的UTMD条件。2w/cm2，60s，10ulMB，50%DC条件下，BRB在辐照后5 min有通透性增加，15 min达高峰，30 min开始恢复，45min恢复正常。.（3）探索UTMD“可逆开闭”血视网膜屏障的机制。UTMD作用于视网膜色素上皮细胞体外屏障模型，TER的可逆性改变说明屏障通透性的可逆性改变；Occludin表达的可逆性改变初步说明“可逆开闭”的分子学机制。.（4）体内证实UTMD技术能够促PEI/pDNA转染视网膜，为后续治疗实验奠定基础。.（5）体内证明UTMD技术能够“可逆开闭”血视网膜屏障。在2 W/cm2条件下，BRB通透性在辐照后5 min增加，15 min达高峰，30 min开始恢复。.（6）UTMD技术联合rAAV2-MERTK有效提高MERTK的表达，治疗RCS大鼠视网膜色素变性。..科学意义：.（1）在合适的超声辐照条件及微泡浓度下，UTMD能够“可逆开闭”BRB屏障，揭示UTMD“可逆开闭”BRB的机制，搭建视网膜基因转染的技术平台。.（2）UTMD联合rAAV-MERTK基因转染RCS大鼠，能够有效治疗RP,为视网膜疾病的基因治疗提供新思路。