剪接体Prp8蛋白Switch loop调控pre-mRNA剪接机制研究

A common evolutionary origin is generally being accepted between the spliceosome and the group II intron, evidenced by shared RNA catalytic elements in both entities. However, no corresponding element of exon-binding site 2 (EBS2) from group II is found in spliceosomal RNA. Previously, we localized the position of Prp8 in the spliceosome by means of immuno-electron microscopy and analyzed the evolutionary property of Switch loop sequence. Here, by scrutinizing the conformation similarity between Prp8 Switch loop and EBS2 in their respective structures, we proposed that, as EBS2 functions in group II, Switch loop gained the ability to regulate splicing during spliceosome evolution. Based on functional experiments including yeast mutant construction and in vitro splicing assay, our hypothesis will be tested by investigating the effect of Switch loop truncation or mutation on nuclear pre-mRNA splicing and factors involved, with the purpose of elucidating the molecular mechanism of Switch loop in splicing. This study will enhance our understanding of Switch loop in nuclear pre-mRNA splicing, and expand our vision toward the origin of the spliceosome and the group II intron.

通常认为剪接体与II型内含子具有共同起源，剪接体催化中心RNA在结构和功能上分别对应于II型内含子重要位点。迄今并未在剪接体RNA中发现类似II型内含子的exon-binding site 2（EBS2）的序列。前期工作中我们通过免疫电镜方法确定了Prp8在剪接体中的位置，并分析了Switch loop的序列特征。基于剪接体Prp8蛋白Switch loop与EBS2的空间相似性，我们推断Switch loop在剪接体进化过程中获得了类似EBS2调控剪接的功能。本课题拟通过构建酵母Switch loop突变体菌株和体外剪接实验系统，研究Switch loop缺失或突变对剪接过程和相关因素的影响，从而阐明Switch loop在pre-mRNA剪接反应中的作用机制。本研究将加深对剪接体蛋白在pre-mRNA剪接反应中机制的认识，并拓宽对剪接体与II型内含子起源关系的理解。

本项目对剪接体Prp8蛋白上的一段大约40个氨基酸残基的motif，Switch loop的功能进行了初步研究。Switch loop在剪接体催化过程中存在两种构象改变，这两种构象的改变分别对应于催化前的剪接体状态和催化后的状态。这种构象的改变表明Switch loop在催化过程中可能存在具有重要的调控作用。我们研究了Swtich loop缺失对酵母细胞生长的影响。通过半乳糖诱导系统，我们发现其缺失后导致细胞生长的抑制。我们进一步对细胞的周期进行了检测，同样发现周期相关的剪接基因和调控激酶基因表达的改变。然而对内含子剪接的检测却表明，Switch loop的缺失并不影响剪接的发生。提示Switch loop抑制细胞生长和阻滞细胞周期的效应并不是通过调控内含子剪接，而存在其他未知的调控机制。我们的工作揭示了Switch loop对细胞生长和细胞周期进展的重要功能，提示Prp8蛋白存在不依赖于剪接而影响细胞状态的新机制。揭示这种新机制的分子机制将是我们下一步工作的重点。此外，我们还对纤细裸藻（Euglena gracilis）的剪接系统进行了生物信息学的鉴定分析。我们通过二代和三代转录组测序，鉴定了166个剪接基因。我们还基于纤细裸藻的部分基因组序列，通过同源分析确定了其U2和U6的序列。U2/U6的RNA二级结构和大量剪接基因的鉴定表明，纤细裸藻的剪接系统与人的剪接系统类似。最后，我们还对真核生物的剪接体进化和起源进行了初步的探讨，并建立了两种快速而高效的纤细裸藻细胞转化方法。由于纤细裸藻剪接类型的独特性，对其剪接体的研究将为我们揭示新的剪接机制。