人脐带间充质干细胞复合生物网片治疗先天性无阴道及其分子机制探讨

The incidence of Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser syndrome (MRKHS) is estimated to be 1 in 4000-10000 live-born girls. There is a great variety of vaginal reconstruction techniques, which suggests there is no single superior surgical technique. The ideal material should be biocompatible, non-autologous, resistant to infection, independent of vaginal mould, and the length, morphology, and wetness of the neovagina should be satisfying. This study is based on our previous experience of vaginoplasty with acellular porcine small intestinal submucosa graft (SIS graft) in MRKHS patients. Vaginoplasty with SIS graft had the advantages of no need to take autologous tissue, less trauma, and no scar. However, it also had the disadvantages of long mould wearing, and unsatisfied vaginal length of some patients. This study is based on our previous study, and focused on the possibility and molecular mechanism of vaginoplasty using human umbilical cord mesenchymal stem cell (hUCMSCs) compounded with SIS graft. The study design is as follows: Construct the hUCMSCs/SIS graft compound in vitro; comparing the vaginal length after vaginoplasty using hUCMSCs /SIS graft compound or using only SIS graft in New Zealand rabbit; observe the in vitro and in vivo effect of estrogen and various growth factors on the growth of hUCMSCs on SIS graft and observe the effect on the MAPK signaling; observe the in vitro and in vivo effect of growth factor transfection on the growth of hUCMSCs on SIS graft and the effect on the MAPK signaling.

我国人口基数大，先天性无阴道患者并不少见。目前有多种阴道重建的手术方式和代阴道的材料，各有其优缺点。本课题组已采用猪小肠粘膜下层（SIS）生物补片进行人工阴道成形术治疗先天性无阴道。使用生物补片进行阴道重建，具有不需要取自体组织，腹壁无疤痕，创伤小的优点，但术后佩戴模具时间长，部分患者的阴道长度欠满意。本研究拟在我们前期的工作基础上，研究人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）复合生物网片治疗先天性无阴道的可行性及其分子机制。研究内容：体外构建 hUCMSCs /SIS网片复合体；建立新西兰兔无阴道模型，比较SIS生物网片负载hUCMSCs相对于单纯使用SIS生物网片对新西兰兔人工阴道生长的影响；观察雌激素及多种生长因子体外体内对SIS生物网片负载hUCMSCs的生长的有无促进作用及对MAPK各亚通路的影响；观察hUCMSCs质粒转染生长因子体外体内对人工阴道生长及对MAPK各亚通路的影响。

背景 我国人口基数大，先天性无阴道患者并不少见。目前的各种阴道重建术式和代阴道材料各有优缺点。本课题组此前采用猪小肠粘膜下层（SIS）生物补片进行人工阴道成形术治疗先天性无阴道，具有无需取用自体组织、腹壁无疤痕、创伤小的优点，但术后需患者长时间佩戴模具且部分阴道长度欠满意。本研究在前期工作基础上，探讨人脐带间充质干细胞（hucMSC）复合SIS网片治疗先天性无阴道的可行性及其分子机制。.主要研究内容 体内及体外研究hucMSC复合SIS网片对人工阴道/阴道上皮细胞的促生作用及其机制。.重要结果&关键数据 成功培养并完成hucMSC生物学特性鉴定后，我们明确了hucMSC与SIS网片具有良好生物相容性，并成功构建hucMSC粘附、伸展及增殖良好的hucMSC/SIS网片复合体。同时我们还发现，hucMSC在体外可以成功被诱导分化为上皮细胞，具有良好上皮分化潜能。采用无阴道SD大鼠模型进行体内研究发现，相较于单纯SIS网片移植和hucMSC/SIS网片复合体移植，单纯的hucMSC局部注射对于实验动物的阴道促修复作用效果最佳。为究其中机制，我们提取大鼠阴道上皮原代细胞，与hucMSC共培养。共培养后的功能分析实验表明，大鼠阴道上皮细胞凋亡受到抑制，细胞周期进程受到推进，导致其增殖能力增强。随后我们在人阴道上皮细胞系VK2上也验证了这一实验结果。同时，经过对动物实验中大鼠阴道组织切片分析发现，hucMSC在原位存活并少量增殖，但没有向阴道上皮分化。这说明，hucMSC可能通过分泌的外泌体促进阴道上皮增殖。我们成功采用差速离心法从hucMSC培养上清中分离得到高质量的外泌体（hucMSC-Ex）并完成其处理VK2细胞后的功能分析。结果显示hucMSC-Ex可以重复出hucMSC对VK2细胞的促生长表型。进一步研究发现，hucMSC-Ex被VK2内化后，其中特异性富集的miRNAs-100、146a、221等可靶向VK2细胞wnt等信号通路，通过抑制细胞凋亡和推进细胞周期而促进VK2细胞增殖。.科学意义 hucMSC可以在体内体外促进阴道上皮生长，且其分泌的外泌体在体外具有与之相同效用，可初步认为将之用于先天性无阴道的阴道成形术的术后辅助治疗是可行的。