SUV39H1/2基因表达抑制对转基因克隆猪胚胎早期发育潜能及外源基因表达水平的影响研究

Transgenic cloning animal has a broad application in agriculture and medicine fields, but the low production efficiency of current transgenic animal technology limits its application and development. The main reason is related to prospects, such as the low efficiency of somatic cell nuclear transfer technology, the low integration rate of exogenous gene and gene expression silence. SUV39H1/2 genes, which play an important role both in the somatic cell reprogramming and the regulation of gene transcription activity, are selected to be studied. The porcine fibroblast lines with stable expression of exogenous gene are selected as materials, RNA interference technology and nuclear transfer method are used to explore the effect of down regulating the expression of SUV39H1/2 genes on the developmental potential of porcine transgenic cloned embryos and the transgene expression levels. The expression of genes related to the zygote genomic activation, the early embryonic development, DNA methylation and histone acetylation are analyzed, the changes of promoter methylation level of exogenous gene in transgenic cloned pig embryos were detected, which would clarify the mechanism of SUV39H1/2 genes. The results would help us to further know the function of SUV39H1/2 genes in somatic cell reprogramming and regulating gene translation activity, and lay the foundation to improve the production efficiency of transgenic cloning animal.

转基因克隆动物在农业和医学领域有着广泛的应用前景，目前制约该技术应用和发展的主要问题是生产效率不高，这主要与体细胞核移植效率低、外源基因整合率及基因表达沉默等因素有关。项目选择在体细胞重编程和调控基因转录活性两方面均具有重要作用的SUV39H1/2基因为研究对象，以稳定表达外源基因的猪成纤维细胞系为材料，采用RNA干扰技术及核移植方法研究SUV39H1/2基因表达调控对转基因克隆猪胚胎早期发育潜力及外源基因表达水平的影响。通过分析重构胚合子基因组激活及早期胚胎发育相关、DNA甲基化和组蛋白乙酰化等重要基因的表达水平，以及外源基因启动子甲基化变化初步阐明其作用机理。课题研究可为进一步解析SUV39H1/2基因在体细胞重编程及基因转录调控功能、完善转基因克隆动物生产技术体系打下基础。

体细胞核移植效率偏低、转外源基因整合率及表达不高等因素是制约转基因克隆动物在农业和医学上广泛应用的瓶颈。为了解组蛋白H3K9me3相关的SUV39H1/2基因在体细胞重编程和调控基因转录活性两方面的作用，课题分别以稳定表达外源基因的体细胞系和猪体细胞克隆胚胎为材料，采用RNA干扰技术及核移植方法分析了SUV39H1/2基因表达调控对转基因细胞中外源基因表达水平、克隆猪胚胎早期发育潜力的影响及机理。结果发现，与对照组相比，在稳定表达干扰素α-2b（interferon α-2b，IFNα-2b）的Bcap-37细胞系中抑制SUV39H1基因表达，可使外源IFNα-2b基因的表达量显著提高（P<0.05），DNMT1、HDAC1和G9a基因的表达显著降低（P<0.05）， HAT1基因的表达量显著提高（P<0.05）。细胞免疫组化和QRT-PCR结果显示，H3K9me3、SUV39H1/H2在孤雌激活和体细胞核移植猪早期胚胎中的表达模式不同，同时适当地抑制SUV39H1/H2基因表达可促进猪成纤维细胞生长。以SUV39H1/H2 shRNA病毒感染供体细胞进行猪核移植试验，结果显示，与未处理组相比，抑制SUV39H1/H2基因表达显著促进核移植早期胚胎分裂、显著提高猪核移植胚胎的囊胚率以及囊胚平均细胞数（P<0.05）。不同MOI病毒感染组间比较发现，SUV39H1/H2基因表达抑制程度的增加，对猪核移植胚胎的分裂率和囊胚平均细胞数没有显著影响（P>0.05），对囊胚率形成有显著促进作用（P<0.05）。采用组蛋白H3K9me3的SUV39H1/2和G9a的特异性抑制剂毛壳素（chaetocin）分别处理猪成纤维细胞和核移植胚胎，发现毛壳素处理整体降低了克隆胚胎H3K9me3、SUV39H1、SUV39H2和G9a基因的表达，其中SUV39H1、G9a和SUV39H2基因在2-细胞、4-细胞期胚胎中的表达显著降低（P<0.05）；合子基因组激活相关的eIF3A和TFIIA基因在2-细胞和4-细胞期胚胎中的表达显著提高（P<0.05），同时显著提高了囊胚中早期胚胎发育相关的Nanog和Oct-4基因表达（P<0.05）。以上研究结果为进一步解析SUV39H1/2基因在体细胞重编程及基因转录调控功能、完善转基因克隆动物生产技术体系奠定了基础。