催化合成三聚半乳糖的嗜热β-葡萄糖苷酶的催化机制研究及分子改造

Galactooligosaccharides (GOS) are the main active components of prebiotics, which can promote the growth of intestinal probiotics and lead to health benefits. GOS are widely used as additive in milk and health foods in western countries. Currently, all GOS used for prebiotics in market are mixture with different degree of polymerization (DP). Different DP causes different function and bioavailability. Except us, there is no report for producing GOS with the single DP from natural saccharides till now, even for the mechanism. A thermophilic β-glucosidase TN0602 could catalyse lactose to synthesis galacto-trisaccharide, which was the unique DP of the GOS product in our previous study. It is very important to explore the mechanism of catalyzing GOS production and confirm the specific residues which affect the product specificity. This is the theoretical basis for designing mutant enzyme to produce different DP of GOS as we want. In this study, we will use molecular modeling to get the structure of TN0602, use molecular docking to analysis the structural basis of the product specificity of TN0602, confirm the key residues combing with the site-specific mutation, and explore the effect of the shape of active center pocket. The target is to get new enzyme which can produce specific GOS by modify the key residues and adjust the transferase/hydrolase ratio. This study will provide a new insight into the enzymatic modification for product specificity.

低聚半乳糖GOS是益生元的主要功能性成分，能促进肠道益生菌的生长，利于人体健康，在欧美及日本等国家被广泛添加于牛奶和保健食品中。但目前用于益生元的GOS均为聚合度不等的混合物，不同聚合度的GOS功效和生物利用度差别较大。而利用天然糖经转糖苷反应生成单一组分GOS的研究极少，更没有机理方面的研究，我们的前期研究发现嗜热β-葡萄糖苷酶TN0602能催化乳糖聚合生成单一聚合物GOS3。揭示TN0602催化合成GOS3的机理，确定影响产物特异性的结构基础，可为糖苷酶的特定改造以获得能够生产特定聚合度的益生元提供理论依据。本项目以TN0602为研究对象，通过分子结构模拟及酶分子对接分析其高产物特异性的结构基础，结合定点突变技术确定关键氨基酸及序列，揭示酶活性口袋空间结构的影响；通过对关键氨基酸残基的改造、调节转糖苷/水解比率获得能够生成特异产物的突变酶，本研究将为酶产物的特异性改造提供新思路。

低聚半乳糖GOS是益生元的主要功能性成分，能促进肠道益生菌的生长，利于人体健康。但目前用于益生元的GOS均为聚合度不等的混合物，不同聚合度的GOS功效和生物利用度差别较大。而利用天然糖经转糖苷反应生成单一组分GOS的研究极少，更没有机理方面的研究。本项目以前期研究发现的嗜热β-葡萄糖苷酶TN0602能催化乳糖聚合几乎只生成单一聚合物GOS3为基础，通过分子结构模拟及酶分子对接分析其高产物特异性的结构基础，结合定点突变技术确定了酶活性口袋中影响酶活性的关键氨基酸残基。glycone（-）亚位是结合并水解乳糖的主要位置，突变体W383F的水解活力提高了近50%，但转糖苷活力与野生型相当；而F414S/Y突变体因与乳糖的结合力降低导致水解活力明显降低，但转糖苷活力增强，GOS总产量最高提高了近1倍。糖基受体aglycone（+）亚位选择的氨基酸突变中，F226G空间位阻大大降低，水解乳糖活力提高了5倍，转糖苷活力也提高了约20%，有GOS4生成；N246突变为空间位阻更小的Gly和带电荷的Glu，水解活力都明显提高（50倍和5倍），但转糖苷活力没有提高，说明N246位点是影响转糖苷活性的关键氨基酸残基；N222位点对转糖苷活性有重用影响，饱和突变体中获得了转糖苷活性提高及GOS水解速率明显降低且只有GOS3合成（N222E/H/V/L/G）和GOS4产量提高（N222W）的突变体。F226G/F414S/Y双突变体通过降低糖基受体位的空间位阻，改善F414单点突变体与乳糖的结合力，明显提高了转糖苷活力及GOS4的产量。由此证明，活性口袋的空间位阻与氨基酸侧链极性、疏水性和大小等对底物的稳定作用对转糖苷活力都有重要影响。通过对关键氨基酸残基的改造、调节转糖苷/水解比率获得能够提高GOS3产量的突变酶F414S、F226G、N222D/Q/W及双突变体F226G/F414S/F等，本研究为酶催化特异性改造提供了新思路。