用树体环剥技术快速分析油茶基因功能的方法研究

根据砧木RNA沉默源的沉默信号可在植物体内长距离传导的原理，视油茶树干环剥面为外植体，直接在野外模拟植物转基因流程，环剥面生成的愈伤组织转基因细胞群作为"主"沉默源；根据病毒自发的系统侵染特点，将病毒载体工程菌液注射于环剥口作为"辅助"沉默源。此二沉默源的沉默信号传导至油茶树体上部沉默靶基因，从而可研究基因的功能。以PDS为标记基因，根据嫩叶漂白表型的程度及靶mRNA相对含量来检验RNA沉默效果和优化各处理参数；在单基因的沉默方法优化基础上研究多基因联合沉默的方法。本课题所创方法体系不需知晓靶基因全长cDNA、也不需获得转基因植株，就可快速、较直观地反映基因的功能表型，流程简单，周期短，研究成本低廉；不仅适用于单基因的功能研究，也可应用于多基因的功能分析，还将能直接应用于油茶的分子改良。

目前国内尚未有油茶转基因成功的报道。本研究目的是，在油茶树体的某一部位获得RNAi转基因细胞团，其内产生的RNA沉默信号运输至作用部位，通过预期表型症状的强度体现油茶转基因技术体系的有效性。本研究中我们对盆栽油茶嫁接苗的根部通过转基因流程导入phytoene desaturase (PDS，八氢番茄红素脱氢酶基因)的发夹结构，结果在其嫩叶上观察到预期的漂白症状(图1C、图10E、F)，初步证实：农杆菌LBA4404可有效介导油茶的转基因，转基因部位产生的RNA沉默信号可以在茎部向上运输。.我们首先克隆了PDS的片段，采用Gateway技术成功构建了油茶PDS的3个发夹结构(图2-图5)，并分别转化了LBA4404。按照预先设计的方案，春季直接在田间对环剥油茶树干和枝梢进行农杆菌的侵染(图7)；考虑到春季环剥部位愈伤组织的诱导可能不顺利，增加了嫩叶侵染实验(图8)。虽然没有在环剥部位观察到预期的愈伤组织(图8F)，也未在梢部观察到漂白症状；不过，在梢部侵染并同时进行叶片侵染的新出嫩叶上出现了漂白症状(图8D)，但因不能区分PDS沉默和遮光的各自贡献率，尚不能确认这种漂白症状就是PDS沉默所致。.为完成研究目标，重新设计了油茶苗木根部的侵染方案：油茶小苗断根，在萌发新根前浇灌农杆菌液侵染并用除草剂筛选，则萌发的新根或愈伤组织中可能就含有PDS-RNAi转基因细胞。这种侵染因在栽培基质中进行，不必考虑光照对农杆菌的影响。对实生苗的断根侵染未获得预期症状(图9B、C)，而采用嫁接苗在调整侵染时的环境温度(图10A)后获得了预期的漂白症状(图10E、F)。因为侵染的植株一直培养在含有除草剂的基质中，最后苗木死亡，也由于出现漂白症状的苗木太少，不能取样进行Southern blotting、qRT-PCR等分子生物学的转基因验证和表达定量分析。.田间试验受控于天气和季节，苗木根部侵染受制于苗木本身和实验空间，一年内难再行重复。现改用组培苗在室内进行侵染，可不受时间和空间的制约，目前已获得近3000株芽增殖组培苗。按照调整后的实验设计，正抓紧实施，预计在一年的时间内油茶转基因成功。