植物根内生真菌印度梨形孢的LysM效应蛋白PIIN_00867的分离鉴定及其拟南芥受体激酶的分离鉴定

Piriformospora indica is a root endophytic fungus, and can symbiose with a great range of plants, including Arabidopsis thaliana, and shows strong functions of physiology and ecology, thus the symbiosis will have great applications in agriculture and forestry, especially in the current situation that rural non-point source pollution is very serious in China. The symbiotic structures are completely different from nodules and mycorrhizae. The signal molecules secreted by rhizobia and mycorrhizal fungi have been isolated and identified and their receptor kinases have also been characterized in some host plants, but signal molecules secreted by P. indica and their receptor kinases have not been isolated and identified. Because the genomes of A. thaliana and P. indica have been sequenced, the symbionts can form a very useful model of symbiosis system. We shall use this model to investigate the molecular crosstalk mechanisms between P. indica and A. thaliana. The main scientific problems will be studied: (1) isolation and identification of LysM effector protein PIIN_00867 secreted by P. indica during colonization; （2）what receptor kinase in root epidermal cells of A. thaliana will sense PIIN_00867 protein and carry out signaling? If the two problems are resolved, it is very important to know the symbiosis mechanism and helpful to apply the fungus in agriculture and forestry.

印度梨形孢是一种有益的植物根内生真菌，它与寄主共生形成的结构不同于根瘤和丛枝菌根。印度梨形孢能与许多植物（包括拟南芥）共生，具有很强的生理生态功能，因而将在农林上具有广阔的应用前景，尤其是在当前迫切的减肥减药的形势下。目前，根瘤菌和丛枝菌根真菌在与植物共生之前分泌的信号分子已被分离鉴定，其受体激酶在少数寄主植物中也被分离鉴定，但印度梨形孢分泌的信号分子及其寄主受体激酶则没有被分离鉴定。因拟南芥和印度梨形孢的基因组均已测序，它们可以形成一个非常有用的共生模式系统。我们将利用这个模式系统解决两个关键问题：（1）分离鉴定印度梨形孢分泌的LysM效应蛋白PIIN_00867；（2）拟南芥根系表皮细胞细胞膜上何种受体激酶感应效应蛋白PIIN_00867并转导信号？解决这两个问题，将有助于充分了解印度梨形孢与植物共生的机理，以便更好地将其应用于农林生产上。

在自然生态系统中，植物与许多微生物共生。这种共生关系中，共生的微生物可以促进植物营养吸收，增加植物生长，且能促进植物的抗逆性。在此过程中，微生物的效应蛋白具有重要作用，然其作用机理并不清楚。本项目主要研究了印度梨形孢三个效应蛋白（PIIN_00867、PIIN_05330、PIIN_00131）的功能。研究结果如下：（1）PIIN_00867基因拟南芥转化植株N1和N5具有早开花的现象，这与蛋白PIIN_00867调节拟南芥开花基因有关，即该基因显著下调与开花相关的基因CO、CRY-2、GA3、FLC、SOC1和LFY，而显著上调CRY-1、FCA、SPL9和FT。在盐胁迫下，该基因导入没有对抗氧化酶活性产生显著影响，而显著增加GSH、AsA和脯氨酸含量，显著降低MDA含量。蛋白-糖互作实验表明，PIIN_00867蛋白与N-乙酰化壳三糖没有相互作用。（2）在干旱条件下，PIIN_05330转化植株L1和L2的根系形态没有显著变化，而其根尖数量显著增加；同时其抗氧化酶活性没有显著变化，但AsA含量显著增加，脯氨酸含量无显著差异，H2O2和MDA含量显著降低。PIIN_00131转化植株M2和M4也具有早花现象，其CO、FLC、SOC1基因显著下调，而CRY-1、FCA、SPL9、FT和AP1则显著上调。（4）酵母双杂分析初步确定了拟南芥中可能有10个蛋白与PIIN_00867蛋白互作，有4个可能与PIIN_00131蛋白互作。它们的靶蛋白仍有待于进一步确定。（5）转录组分析表明，接种与未接种的拟南芥比较，在冰冻胁迫下，有634个DEGs，接种主要通过控制表达胁迫相关的蛋白的表达，这些蛋白涉及脂肪合成、离子运输、代谢途径以及激素信号转导途径。这些结果表明印度梨形孢可以提高植物冰冻抗性。（6）印度梨形孢接种于拟南芥可以增加冰冻胁迫后恢复期可溶性蛋白、脯氨酸以及抗坏血酸含量，而降低H2O2和MDA含量。同时BR和ABA含量以及与冰冻胁迫相关的几个基因（CBFs、CORs、BZR1、SAG1、PYL6）的表达水平增加。（7）茎瘤固氮根瘤菌可以定殖于西红柿的茎和根的细胞间隙。在盐胁迫下，茎瘤固氮菌与印度梨形孢共同接种可以促进西红柿生长，且可提高抗氧化酶活性以及抗氧剂AsA和GSH含量，还可以提高西红柿果实中可溶性蛋白和AsA含量。