浮游植物中非典型碱性磷酸酶PhoAaty表达模式和酶学特性的研究

This project would represent a systematic effort to characterize PhoAaty, a newly classified atypical type of alkaline phosphatase in dinoflagellate and coccolithophore, in terms of gene and protein expression and enzyme properties as well. This study will focus on Emiliania huxleyi (prevalent species in oligotrophic ocean) and Karenia mikimoti (notorious HAB forming species in the eutrophic costal waters), because of the significant difference of nutrient niche between them. This project will investigate the gene transcription, protein expression and enzyme activity of phoAaty in these two algae strains cultured under different phosphorus nutrient condition, including Pi-replete, Pi-depleted and various phosphoesters as sole P source. The main goal of the comparative analysis is to identify the differences of both gene regulation and the substrate specifity between theses two species to gain understanding on the DOP utilization strategies in phytoplankton. To further identify the cofactor requirement by PhoAaty, a series incubation experiments with metal ion candidates separately will be performed on the cells in vivo, extracted total protein and prokaryotic expression products. We will also investigate the optimum pH profiles of PhoAaty in more phytoplankton species. In general, combined with the understandings of substrate specificity and cofactor requirements，the output of this project will provide more insights for us to understand the molecular mechanism of phosphoesters utilization through PhoAaty in marine phytoplankton and ecological implications.

本项目以在甲藻和球石藻中存在的一类非典型碱性磷酸酶PhoAaty为研究目标，选择磷营养生境差异较大的球石藻Emiliania huxleyi（寡营养海区优势种）和米氏凯伦藻Karenia mikimotoi（我国东海富营养化海区赤潮原因种）开展比较研究。设计开展不同磷营养培养实验，通过检测基因转录水平、蛋白表达水平、酶活性和细胞生理观测数据，比较分析PhoAaty在不同研究对象中表达调控机制的种间差异，以及其利用磷酸酯类化合物的底物特异性；同时开展PhoAaty的酶学特性所需的金属辅因子和最适pH的相关研究。本项目的研究成果将进一步厘清真核浮游植物通过表达PhoAaty利用磷酸酯应对无机磷限制的分子响应机制，对底物的偏好性和酶活性所需的金属辅因子也将从磷营养的角度，为进一步了解真核浮游植物不同种的生态适应机制提供科学依据。

本项目围绕“浮游植物中非典型碱性磷酸酶PhoAaty表达模式和酶学特性的研究”开展了系列研究，为了解不同类型浮游植物的磷营养策略以及潜在的生态适应机制提供科学依据。研究内容和重要结果如下：鉴定得到在颗石藻中也存在非典型碱性磷酸酶EH-PhoAaty，基因序列不同于该种中已报道碱性磷酸酶EHAP1，EH-PhoAaty的基因转录和蛋白表达受细胞外磷浓度的调控，但是其基因表达模式与EHAP1的基因表达模式不同，细胞定位预测结果表明EH-PhoAaty可能定位在细胞膜上，而已报道的EHAP1是分泌到细胞膜外。两种碱性磷酸酶的表达模式和细胞定位的差异说明其执行的功能不同，表明颗石藻有机磷利用机制的复杂性；开展了甲藻中非典型碱性磷酸酶PhoAaty活性所需金属辅因子的分析，选取了甲藻中具有重要生态意义的代表种，包括形成赤潮的强壮前沟藻、亚历山大藻、米氏凯伦藻、微小原甲藻以及和珊瑚共生的虫黄藻，结果显示有别于经典的碱性磷酸酶活性所需的Zn2+，补充添加Ca2+，Mg2+，Mn2+都可以不同程度地重新获得酶活性，通过对原核表达PhoAaty蛋白进一步验证其活性仅能通过添加Ca2+而重新获得，与科学假设吻合，表明浮游植物具有PhoAaty可能是对海洋环境中低浓度Zn2+的生态适应机制；甲藻强壮前沟藻中PhoAaty蛋白（ACAAP），其蛋白表达水平同样受到环境中无机磷浓度的调控并与酶活性呈现正相关，与已报道的基因转录模式相吻合；通过对东海原甲藻藻华爆发前后的现场转录本分析，发现其碱性磷酸酶也在藻华爆发期上调表达，表明其可能通过水解环境中的有机磷满足对磷营养盐的生长需求；对三角褐指藻的磷代谢调控元件SPX突变株和野生型进行比较分析，结果显示，三角褐指藻具有多种类型的碱性磷酸酶，其中也包括PhoAaty类型，相较于野生型，突变株在对照组和磷限制组中，酶活性以及PhoAaty基因转录水平均呈显著上调表达，表明其表达受SPX因子调控抑制。本研究表明在定鞭藻、甲藻和硅藻类群中都存在PhoAaty，并且其表达受环境无机磷浓度调控及其活性中心为非传统金属辅因子的特性，赋予了浮游植物更多样的磷营养策略和生态适应机制。