NTs通过NTSR1/Caveolin-3上调HCN通道活性在膀胱过度活动症中的作用机制研究

Overactive bladder(OAB) is a very common clinical bladder dysfunction which has high incidence and complicated pathogenesis. The dysfunction of ICC cells is the basis of bladder detrusor overatvity (DO), and the dysfunction of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel (HCN) mediated Ih current is the key molecular mechanism. Our previous researches have showed that neurotensin can up-regulate HCN channel activity via binding and activating NTSR1 to increase the bladder spontaneous excitability; Activation of caveolin-3 localized in caveolae is the molecular basis of regulating HCN channel expression and function levels；NTSR1 can bind and promote caveolin-3 palmitoylating and translocating onto caveolae for activation.However, whether the NTs can regulate HCN channel opening via activating caveolin-3 is not clear. Accordingly, we hypothesized that up-regulated neurotensin in DO can abnormally increase HCN channel via NTSR1/caveolin-3 pathway to increase bladder excitability. In this study, we will aim to illustrate the molecular mechanism of the regulation of neurotensin on HCN channel, and determine the role of caveolin-3 activated by NTSR1 in the pathological process of DO by applying gene knockout, lentivirus overexpression and RNAi silencing. Illustrating the underlying mechanism systematically might optically bring us new strategies for medical research and clinical treatment of detrusor overactivity.

膀胱过度活动症（OAB）发病率高病因复杂，ICC细胞为核心的逼尿肌过度活动（DO）是其发生的重要基础，而HCN介导的Ih起搏电流异常是核心机制。我们前期发现DO膀胱上调的神经降压素（NTs）可以结合激活NTSR1，进一步促进ICC细胞HCN通道开放，增强膀胱自发兴奋性；小窝结构域内的小窝蛋白3（Caveolin-3）活化是小窝结构调控HCN通道表达和活性的分子基础；而NTSR1则可通过与胞浆内的Caveolin-3蛋白结合，促进其棕榈化修饰，转位至小窝内活化，而NTs是否通过Caveolin-3调控HCN活性尚不清楚。据此提出假说，DO时上调的NTs激活NTSR1促Caveolin-3棕榈化转位，上调HCN通道活性，增强膀胱自发兴奋性。本研究拟通过正/反向调控Caveolin-3表达和棕榈化，阐明NTs调控HCN通道在DO膀胱兴奋性异常中的作用及机制，为DO的基础研究和临床治疗提供新思路。

膀胱过度活动症(OAB) 是一种常见的膀胱功能障碍，主要尿动力学改变是膀胱充盈期出现无意识的逼尿肌自发或经诱发的收缩，即逼尿肌过度活动(DO)。DO的发生机制尚未明确，近年来大量研究发现膀胱内ICC间质细胞的兴奋性异常是其关键环节。基于现有理论，在前期工作基础上，本项目重点探讨了HCN在DO膀胱中的表达和功能差异，以及可能的调控机制。通过PCR和WB检测了NTs及其相关受体mRNA和蛋白表达差异，结果显示DO膀胱ICC细胞中NTs和NTSR1表达增加，原位杂交实验发现NTs的mRNA位于上皮细胞，而分泌蛋白NTs则位于间质层和肌细胞之间，和ICC细胞的分布相一致；原代分离ICC细胞后，通过单细胞膜片钳技术检测了HCN电流，发现DO膀胱ICC细胞中，HCN通道活性增强，使用NTs激活NTSR1后，HCN的功能增强，尤其在DO膀胱ICC细胞中更为明显，证明HCN表达上调和功能增强是DO发生的重要基础；进一步研究发现，大电导钙激活钾（BK）通道在DO膀胱ICC细胞中表达降低，电流减弱，使动作电位复极化，这可能是负性调控HCN活性的重要机制。同时我们发现尿路来源的尿源干细胞（USCs）通过转染HCN4通道蛋白，可诱导其成为具有HCN电流的类似ICC的细胞类型。我们在大鼠DO模型中发现，背根节神经元的A2a受体表达明显上调，其激动剂CGS21680鞘内注射可加重DO症状，而阻断剂ZM241385可抑制DO的发生；通过免疫荧光发现，A2a受体与TRPV1通道共表达于背根节神经元，使用TRPV1通道抑制剂capsazepine可抑制CGS21680诱导的DO症状，这提示TRPV1通道调控的背根节神经元的A2a受体可能是DO膀胱发生的一个重要因素。