粪肠球菌噬菌体裂解酶作用机制研究

Antibiotics-resistant Enterococcus faecalis (E.faecalis) is becoming a major cause of nosocomial infections. So, finding an alternative agent for treating antibiotics-resistant E.faecalis infection is urgent and indispensible. Endolysin from lytic bacteriophage can hydrolyse cell wall of Gram-positive bacteria through a different way compared to antibiotics, and is becoming a potential alternative tool to control bacterial infection. In previous study, we had isolated a lytic bacteriophage in hospital sewage using an E.faecalis strain and identified its endolysin gene. The expressed endolysin can lyse most strains of E.faecalis including vancomycin-resistant strain, but few strains are not sensitive to the endolysin. What leads to the different sensitivity is not clear and deserved to be explored further. In this project, we plan to identify binding domain and catalyzing domain located in the endolysin protein through gene truncation and evaluate their influences on lytic activity. Meanwhile, target molecules and target sites of the endolysin would be identified with mass spectrometry. The distribution of target molecules in sensitive or resistant bacteria strains would also be quantified and characterized. Finally, in this research we will clarify the molecular basis of underlying sensitive difference when E.faecalis strains confronting bacteriophage endolysin and provide a strategy for widing lytic spectrum of endolysin.

粪肠球菌引起的院内感染日益严重，临床上已经出现对多种抗生素（包括万古霉素）耐药的粪肠球菌菌株。来源于噬菌体的裂解酶体外应用能够杀灭革兰氏阳性细菌，裂解酶的杀菌机制与抗生素不同，有望作为替代疗法用于控制耐药菌感染。本项目前期工作从医院污水中分离到一株粪肠球菌裂解性噬菌体并鉴定了裂解酶基因，表达后裂解酶能够裂解大部分临床分离耐药粪肠球菌菌株（包括耐万古霉素粪肠球菌），但仍有少部分菌株对该裂解酶不敏感，不同菌株对该裂解酶敏感性不同的分子机制尚不清楚。本项目拟在前期工作基础上进一步研究该裂解酶的作用机制，运用基因改组技术鉴定其细菌结合域和催化域以及这些结构域对裂解酶活性的影响；利用质谱分析方法研究裂解酶作用的靶分子和靶位点及其在敏感性不同粪肠球菌菌株上的分布特点，阐明粪肠球菌噬菌体裂解酶的作用机制及菌株敏感性不同的分子基础，为改造裂解酶以提高其裂解谱奠定基础。

粪肠球菌为肠球菌属成员，革兰氏阳性、兼性厌氧，广泛存在于人或动物上呼吸道、肠道和生殖道中,该菌对环境抵抗力较强。粪肠球菌通常情况下不致病，但因病人免疫力低下可迁移到其他部位而引起感染，导致败血症、心内炎或脑炎。近年来，粪肠球耐药情况逐渐上升，已出现多药耐药菌株，给该菌的感染防控带来困难。随着细菌耐药问题愈发严重，寻找抗生素以外的抗菌替代方案凸显重要。噬菌体是细菌的病毒，是自然界控制细菌数量的重要因素之一。噬菌体及其来源的裂解酶、解聚酶有望为解决细菌抗生素耐药问题提供替代方案。. 本研究利用一株万古霉素耐药粪肠球菌作为宿主菌，从医院污水中分离到一株裂解性噬菌体。通过全基因组测序、序列分析、基因注释，发现其携带有裂解酶(endolysin)基因LysIME-EF1。该裂解酶蛋白能过够在大肠杆菌内可溶性表达，体外表达的蛋白外用能够裂解粪肠球菌。粪肠球菌噬菌体裂解酶LysIME-EF1包含催化域和结合域。结合域用来识别并结合敏感菌株，介导催化域破坏敏感菌的细胞壁导致细菌裂解。将粪肠球菌噬菌体裂解酶基因LysIME-EF1的结构域与另外一个粪肠球菌噬菌体来源裂解酶相应结构域进行互换，仍然保持裂解活性。. 本研究在此基础上对粪肠球菌噬菌体裂解酶LysIME-EF1的结构进行了解析，在1.75埃的分辨率下获得该蛋白的结构。结构分析发现屎肠球菌噬菌体裂解酶LysIME-EF1蛋白结构由一条该基因编码的全长多肽链与3个N端截短的多肽链组成的四聚体。在此基础上，进一步验证了这条被截短的多肽链是由全长序列上一个内部核糖体结合位点及替换转录起始位点介导表达。同时本研究揭示了屎肠球菌噬菌体裂解酶的钙离子依赖性。本研究首次从蛋白晶体结构角度证实了该类噬菌体裂解酶全酶的结构特征及其形成的分子机理，这些研究结果对于解释裂解酶特异性和作用机制具有重要意义。