TLR4对ANCA相关小血管炎肾小球内皮细胞局部补体活化的作用及机制研究

The abnormal activation of the complement system is an important pathogenesis of renal injury in anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis. The depositing level of the complement activation products in the glomeruli of patients with ANCA-associated vasculitis was proportional to the severity of renal injury, suggesting the importance of the local deposition of the complement activation products. But the source of the glomerular complement activation products is not clear. Our previous study results suggest the possibility of local complement activation in glomeruli. Previous reports demonstrated that Toll-like receptor (TLR) could affect the synthesis of complement factors by intrinsic cells of different organ, and then participate in the activation of complement system. We have also found a high expression of TLR4 on glomerular endothelial cells in patients with ANCA-associated vasculitis. Therefore, we speculate that the upregulation of TLR4 may influence the local complement activation process on glomerular endothelial cells of patients with ANCA-associated vasculitis. This study aimed to elucidate the influence of highly expressed TLR4 on the activation of complement system on glomerular endothelial cells and the possible mechanisms through experiments in vitro and in vivo, which may help to explain the possible relationship between the TLR and complement system. This study could also be meaningful for providing new theoretical and experimental basis for prophylaxis and treatment of glomerular endothelial injury in patients with ANCA-associated vasculitis.

补体系统的异常活化是抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关小血管炎肾损伤的重要机制。ANCA相关小血管炎患者肾小球中补体活化产物的水平可反映肾脏损伤的严重程度，提示肾小球局部补体活化产物至关重要，但是其来源并不清楚。我们前期的研究结果提示了肾脏局部补体活化的可能性，而既往研究发现Toll样受体（TLR）可影响脏器局部固有细胞对补体成分的合成，参与补体系统的活化，我们还发现ANCA相关小血管炎患者肾小球内皮细胞高表达TLR4。因此，我们推测在ANCA相关小血管炎中，肾小球内皮细胞TLR4的上调可能影响内皮细胞局部补体活化过程。本研究拟通过细胞及动物实验，综合利用基因沉默、基因敲除等多种干预和检测手段，探讨TLR4在肾小球内皮细胞表面的表达对肾小球内皮细胞局部补体活化情况的影响及其机制，阐释TLR与补体系统之间的部分联系，并为临床防治ANCA相关小血管炎肾小球内皮细胞损伤提供新的理论和实验依据。

补体系统的异常活化是免疫、代谢相关肾脏病等多数肾脏疾病肾损伤的重要机制。本项目组前期在抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关小血管炎中的研究发现，ANCA相关小血管炎患者肾小球中补体活化产物的水平可反映肾脏损伤的严重程度，提示肾小球局部补体活化产物至关重要，但是其来源并不清楚。我们前期的研究结果提示了肾脏局部补体活化的可能性。而既往研究发现Toll样受体（TLR）可影响脏器局部固有细胞对补体成分的合成，参与补体系统的活化，我们还发现ANCA相关小血管炎患者肾小球内皮细胞高表达TLR4。因此，我们推测肾小球内皮细胞TLR4的上调可能影响内皮细胞局部补体活化过程。为了验证这一假设，本研究拟通过体外及体内实验，探讨TLR4在肾小球内皮细胞表面的表达对肾小球内皮细胞局部补体活化情况的影响及其机制，阐释TLR与补体系统之间的部分联系。. 首先，我们在患者的肾脏组织中进行了TLR4、补体活化产物Bb和内皮细胞标志物CD31的三重荧光染色，发现三者可以共定位，证明了TLR4和补体活化产物在内皮细胞上的空间一致性。体外研究方面，我们采用LPS刺激原代肾小球内皮细胞上调TLR4的表达，同时采用TLR4 siRNA转染下调TLR4的表达，检测体系中补体因子的合成情况、补体调节蛋白和补体受体的表达情况及补体系统活化情况。结果提示TLR4可以影响肾小球内皮细胞多种补体因子的合成。体内研究方面，在LPS诱导脓毒症模型中，TLR4基因敲除小鼠和野生型小鼠相比，肾脏补体因子表达降低，肾小球中补体活化产物表达也明显降低，进一步验证了TLR4的高表达可以增加补体因子、补体活化产物的表达水平。本研究初步证实肾小球内皮细胞中TLR4与补体系统之间存在内在联系，明确了TLR4可以影响肾小球内皮细胞多种补体成分的表达水平，TLR4可能是肾小球内皮细胞补体系统活化的上游调控因子，这为深入探索TLR4与补体两个系统在肾小球内皮细胞损伤中的相互作用提供基础证据，也为肾小球内皮细胞损伤的病理生理机制提供了新思路。