PFOS致斑马鱼游囊发育畸形信号通路的研究

Perfluorooctanesulphonic acid (PFOS), a new kind of persistent organic pollutants, is also one of the exogenous compounds that has been detected with high levels in human body . Recently we found PFOS induced embryonic zebrafish swim bladder deformity and that was consistent with the whole genomic microarray analysis results. Using IPA software, we constructed a swim bladder deformity signaling pathway perturbed by PFOS. Based on this pathway, this project will use RT-PCR method to precisely quantify the gene expression, and then use in situ hybridization (ISH) approach to localize the significant changed genes in embryonic zebrafish. Finally we expect to screen out PFOS responsive genes and their expression leves in the swim bladder. In the second part, we will use interference gene expression approaches such as microinjection MO (down regulate gene expression) or mRNA (up regulate gene expression) to study the function of these genes as well as use western blot or immunohistochemistry methods to study their protein expression. In addition, we will also take advantage of some transgenic zebrafish models, to identify the target genes that are mediating PFOS induced swim bladder deformities. Our results can be used to screen PFOS exposure responsive molecular biomarkers and for construction of a trangenic reporter fish that can be used for PFOS real-time monitoring.

PFOS是一种新型持久性有机污染物，也是迄今为止人体内检测到的含量最高的外源性化合物。申请者近期发现PFOS对斑马鱼胚胎游囊发育有典型的畸形效应，且与全基因组微阵列分析结果相吻合。本项目以IPA构建的PFOS响应的游囊畸形效应信号通道（59个基因）为研究对象，用RT-PCR重新精确定量，再用原位杂交（ISH）对具显著变化的基因定位研究，从中筛选出6-8个PFOS响应的且在游囊表达的备选基因。第二部分，用显微注射MO或mRNA人为干扰基因表达的方法，结合斑马鱼转基因品系、共聚焦显微观察、ISH、RT-PCR、western blot、免疫组织化学、细胞凋亡、显微切片等实验手段，研究备选基因在基因和蛋白层面上的功能，最终筛选出1-2个PFOS响应的且在游囊发育过程中具重要生命功能的靶基因。研究成果对PFOS响应的新型分子标志物的筛选及未来构建响应PFOS的实时监测报告基因鱼等均具有重要的意义。

PFOS是一种新型持久性有机污染物，也是迄今为止人体内检测到的含量最高的外源性化合物。本课题主要采用斑马鱼模式生物研究了PFOS对游囊发育及其相关的信号通路的影响。研究发现PFOS最敏感的窗口期为48-96 hpf，主要引起游囊关闭和脊柱弯曲的畸形表型，组织病理学分析发现游囊和肠管组织发生显著畸变，如增厚。全基因组芯片检测发现16μM PFOS窗口期暴露造成1278个差异表达基因。信号通路分析发现PFOS引起的毒效靶点包括肠管、游囊和心血管等多种器官和组织，还有PPARα过氧化物酶体增殖物的调控、线粒体膜结构的极化、PPARα/RXRα激活、氧化应激、细胞凋亡等多种生命过程。IPA软件构建了游囊发育相关基因的通路图，qPCR分析发现，游囊标志基因anxa5、acta2和hb9对PFOS暴露的响应十分显著，且变化趋势和全基因分析结果一致，这三个基因为PFOS至斑马鱼游囊发育畸变的靶基因。我们还研究了PFOS的雌激素效应及其对斑马鱼生殖毒性，发现PFOS可通过影响斑马鱼的性激素E2和T的表达水平，引起性腺发育异常，且干扰性别分化关键基因cyp19a、amh和esr1的表达，最终引起斑马鱼雌性化的发展结果。PFOS对不同性别斑马鱼代谢系统的毒性机制研究发现0.5μM PFOS全世代暴露引起斑马鱼雄鱼肝脏中大量脂肪堆积，脂质水平上升，肝体指数上升，以及各相关基因表达紊乱，但是对雌鱼的影响却不大。此外，我们还研究发现PFOS引起λCII转基因青鳉鱼的致突变效应，提出了PFOS诱导肝脏基因突变的发生是由肝脏功能受损介导的科学假说。同时研究了PFOS对斑马鱼的甲状腺毒性及其作用机制，发现PFOS可干扰斑马鱼中甲状腺素T4/T3的表达水平，影响甲状腺滤泡的形态发育及相关调控基因的差异表达。还研究了PFOS对斑马鱼成鱼及其子代神经行为的影响，发现在不同的发育阶段，长期暴露于低剂量PFOS可显著影响成年斑马鱼的运动行为，以及F1代胚胎的发育和行为运动。总之，本研究筛选到了多个PFOS响应的新型分子标志物，对未来构建响应PFOS的实时监测报告基因鱼等均具有重要的意义。