藏猪精子高原适应性的DNA甲基化机制

DNA methylation plays a very important role in gene expression and regulation. However, it is not yet clear about DNA methylation mechanism of Tibetan pig sperms plateau adaptability. It had been detected that levels of the sperm genome DNA methylation of Tibetan pig was significantly lower than that of Large White pigs’. Next experiments will be carried on as follows：(1) In order to select proteins coded by major genes about the plateau adaptability and DNA transmethylase（Dnmts）, the studys will be implemented by comparative proteomics of HPLC，MALDI-TOF/TOF-MS and the biological information. (2) It will be tested that the expression differences of each proteins between Tibetan pig and Large White pig in sperms by using Western Blot. (3)The mRNA expressive discrepancy of these genes will be detected between sperms of Tibetan pig and that of Large White pig by real-time fluorescence quantitative PCR technique. (4) It will be filtrate that SNPs of major plateau adaptability genes by PCR-RFLP. Based on the experimental data above，it will be clarified that major DNA methylation mechanisms of Tibetan pig sperms plateau adaptability by this project. It will provided the technology for improving the boar Tibetan pig fecundity and establishing molecular breeding，and also provide the reference for other epigenetic mechanism of Tibetan pig plateau adaptability .

DNA 甲基化对基因表达有重要的调控作用，但关于藏猪精子高原适应性的DNA 甲基化机制尚未明了。本项目在我们已检测到藏猪精子基因组DNA 甲基化水平显著低于大白猪的基础上，拟 (1) 用高效液相分离、基质辅助激光解离飞行时间质谱鉴定（MALDI-TOF/TOF-MS）、生物信息学分析等方法对藏猪、大白猪精子进行比较蛋白组学研究，筛选藏猪精子主要高原适应性基因、DNA 甲基转移酶基因所编码的蛋白；(2)采用Western Blot验证这些蛋白在藏猪与大白猪精子中的表达差异；(3)采用实时荧光定量 PCR技术检测这些基因在藏猪与大白猪精子中的mRNA表达差异；(4)采用PCR-RFLP技术筛选藏猪精子主要高原适应性基因的SNPs。本项目拟通过对以上试验结果的分析，阐述藏猪精子高原适应性的主要DNA 甲基化机制，为提高藏猪繁殖力及分子育种等提供支撑，也为藏猪高原适应性的其它表观遗传机理提供参考。

DNA甲基化对基因表达有重要的调控作用，藏猪的雄性生殖系统已适应高海拔条件，但关于藏猪精子高原适应性的DNA甲基化机制尚未明了。本项目用iTRAQ定量技术对藏猪、大白猪精子进行比较蛋白组学研究，以筛选出藏猪精子主要高原适应性候选蛋白；采用Western Blot验证其中4个候选蛋白各自在藏猪与大白猪精子中的表达差异；采用实时荧光定量 PCR技术检测编码这4个候选蛋白的基因各自在藏猪与大白猪精子中的mRNA表达差异；采用PCR-直接测序法筛选这4个基因的SNPs。结果显示，在共鉴定的1 555个蛋白中，有318个差异表达蛋白，这些差异表达蛋白主要富集于肌动蛋白细胞骨架调控、谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化和雌激素信号通路，筛选出8 个候选蛋白(FN1,EGF,HSP90B1,CFL1,GPX4,NDUFA6,VDAC2,CP)；验证的4个候选蛋白（FN1,GPX4，CFL1,EGF）在藏猪与大白猪精子中的表达水平与iTRAQ技术的定量表达水平一致；这4个基因的mRNA 表达也与蛋白表达水平一致；这些SNPs（Cfl1的G-285A、Egf的G584A、Fn1的A-648G、C532G、GPX4的C-495G、C311A）可以作为藏猪分子育种的候选标志。以上结果表明，在高原环境中，与大白猪相比，藏猪精子基因组 DNA 甲基化水平显著低于大白猪的，这可能会影响到藏猪精液品质相关的一些高原环境适应性蛋白的表达，如我们筛选出的8个高原性适应候选蛋白，而藏猪精子中CFL1、EGF、HSP90B1、NDUFA6的高表达有助于生精细胞的增值、分化及精子能量的合成等，FN1、GPX4、VDAC2、CP的低表达有助于降低精子畸形率等，从而使藏猪有较高的精液品质。以上可能是藏猪精子高原适应性的主要DNA甲基化机制，这将为提高藏猪繁殖力及分子育种等提供参考。