聚电解质多层膜基片电泳流动型ELISA系统的研究

In this study, we develop a novel electrophoresis flow enzyme linked-immunosorbent assay (ELISA) system based on functional polyelectrolyte multilayers (PEMs). This ELISA system could improve the detection sensitivity of the conventional ELISA due to lower nonspecific adsorption and overcome the diffusion-limited reaction. The PEMs could be modified on/in to a porous membrane by layer-by-layer process. The physical or chemical adsorption of primary antibody on the PEMs and the suppression ability of nonspecific adsorption of PEMs would be studied. The different kind of proteins could successively permeate through the PEMs modified membrane drived by the electric field of electrophoresis. Hence, the electrophoresis flow ELISA system could separate various proteins on 'time and space' and locally concentrate the antigen around with primary antibody, leading to sensitive and rapid detection. We try to detect disease index protein, C-reaction protein (CRP) and β2-microglobulin, in serum sample. Moreover, we develop a 'separation-detection' synchronizing method to detect small size protein of β2-microglobulin.

利用多功能的聚电解质多层膜（polyelectrolyte multilayers: PEMs）修饰基片，通过电泳技术作为运输检测液体的驱动力，创制灵敏、快速、简便的流动型酶联免疫吸附试验（ELISA）系统。解决常规ELISA系统中检测分子（抗原）及非抗原分子的非特异性吸附导致的低灵敏度问题、及其抗原分子的自由扩散反应的低检测效率问题。利用层层自组装的方法，将PEMs修饰于多孔膜表面及内部，研究其表面的第一抗体的物理吸附或化学结合能力及抑制蛋白质的非特异性吸附程度。电泳电场使不同种类蛋白质分子依次透过多孔膜基片，在时间与空间上分离抗原，并且在短时间的流动过程中使抗原局部浓缩到多孔膜（即第一抗体）近旁，在其他蛋白质的少干扰环境中完成灵敏、快速的抗原-抗体反应。研究C反应蛋白与小分子蛋白β2-微球蛋白在血清溶液中的定量检测，并且研究分离与检测同步法进行β2-微球蛋白的定量检测。

酶联免疫吸附试验（ELISA）作为金本位的少量蛋白质检测和定量试验，广泛地应用于食品、工业、环境检测和临床医学等领域。本研究利用多功能的聚电解质多层膜（polyelectrolyte multilayers: PEMs）修饰基片，通过电泳技术作为运输检测液体的驱动力，创制灵敏、快速、简便的流动型ELISA系统。解决了常规ELISA系统中检测分子（抗原）及非抗原分子的非特异性吸附导致的低灵敏度问题、及其抗原分子的自由扩散反应的低检测效率问题。利用层层自组装的方法，将PEMs修饰于多孔膜表面及内部，研究了其表面的第一抗体的物理吸附或化学结合能力及抑制蛋白质的非特异性吸附程度。电泳电场使不同种类蛋白质分子依次透过多孔膜基片，在时间与空间上分离抗原，并且在短时间的流动过程中使抗原局部浓缩到多孔膜（即第一抗体）近旁，在其他蛋白质的少干扰环境中完成灵敏、快速的抗原-抗体反应。 . 本研究的电泳ELISA检测体系的主要结果如下：抗体抗原反应的孵育时间仅为2 min，是常规ELISA的1/30，并且C反应蛋白即使在血清蛋白的干扰条件下，同样能达到高检测灵敏度（33 pM），同时具有较宽的线性检测范围0.013至50 nM。另外结合了电泳驱动，微球信号放大与ELISA检测体系优势，构建了一种双重电泳驱动抗原-抗体反应的快速、灵敏的ELISA新方法。双重电泳驱动，即抗原，第二抗体修饰微球在电泳驱动下，分别迅速流动到第一抗体固定的多孔膜周围，形成抗原、第二抗体的局部浓缩，实现快速检测。两步骤的检测时间都仅为2分钟，所以比常规ELISA检测时间缩短了近两个小时。另外，利用抗体修饰微球检测，不仅大幅度放大了检测信号，而且由于电泳检测缩短了抗体与抗原的反应时间，也同时大大降低了噪音信号（非特异性吸附）。其检测灵敏度达到130 fM，检测范围为0.13至130 pM。以上结果表明，新型电泳ELISA检测系统能够广泛应用于快速、灵敏、简便的免疫检测体系，为分离检测同步完成体系提供了强有力的理论依据。