基于ATF4和GRP78靶点研究酸浆中睡茄内酯类物质抑制人骨肉瘤化疗耐药发生的作用

The current studies of anti-chemoresistance in osteosarcoma focus on finding safe reversal agents, lots of works have been done but the results are poor. Therefore, we search for a novel strategy to prevent drug-resistance occur in the initial treatment with chemotherapy. Previous studies indicated that ATF4 and GRP78 which are important targets mediate the development of drug-resistance. ATF4 up-regulation combines with GRP78 inhibition prevents chemoresistance development induced by doxorubicin at the beginning of the incubation. We found that a kind of withanolides: Physagulin C extracted from Physalis alkekengi var.franchetii (Mast.) Makino facilitates ATF4 expression and suppresses GRP78 up-regulation, and increases the sensitivity of resistant osteosarcoma to doxorubicin. Physalis alkekengi var.franchetii (Mast.) Makino is traditional Chinese medicine, it can be clearing heat and detoxicating, relieving sore-throat, eliminating damp-heat and promoting urinary discharge. Recently, scientists found Physalis alkekengi var.franchetii (Mast.) Makino has antineoplastic effect, the basis is withanolides. We will isolate withanolides from Physalis alkekengi var.franchetii (Mast.) Makino, test their promotion on ATF4 or inhibitory effect on GRP78, and study their mechanisms regarding preventing the development of chemoresistance in osteosarcoma. This study will provide new strategy and research foundation for Physalis alkekengi var.franchetii (Mast.) Makino in the therapy of osteosarcoma.

目前对逆转人骨肉瘤化疗耐药的研究，大多集中于寻找高效且低毒的逆转剂使耐药肿瘤对化疗复敏，虽投入了大量人力、物力但收效甚微。因此申请者不再重点关注人骨肉瘤化疗耐药形成后的治疗策略，而是聚焦于研究如何克服化疗耐药的产生，即在化疗初期便抑制肿瘤耐药的发生。前期研究表明，ATF4和GRP78是介导耐药发生的重要靶点，高表达ATF4并抑制GRP78能在化疗初期有效阻碍化疗耐药的产生。申请者发现从酸浆提取的睡茄内酯类物质Physagulin C既能上调ATF4又可以抑制GRP78表达，并能提高耐药骨肉瘤对阿霉素的敏感性。酸浆是我国的传统中药材具有清热解毒、利咽化痰、利湿除热的功能，其功效符合中医治疗骨肉瘤的用药策略。近年来研究人员发现酸浆中的睡茄内酯类成分具有抗肿瘤的活性；申请者将从酸浆中提取睡茄内酯类物质进行研究，以期寻找出能克服人骨肉瘤耐药产生的活性单体，为酸浆用于骨癌治疗的新用途提供理论基础。

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，主要影响儿童、青少年和年轻成人。尽管通过手术和联合化疗等新兴治疗策略，有望延长骨肉瘤患者的生存期，但化疗后的获得性耐药仍然是很棘手的问题。硼替佐米（bortezomib，BTZ）对蛋白酶体的抑制作用，促进有害的蛋白质积累和聚集，扰乱蛋白质稳态，并激活内质网应激诱导的凋亡通路。虽然硼替佐米在实体肿瘤中的临床试验已经有很多，但由于前期临床缺乏显著的成功，阻碍了其进一步研究。许多信号通路与骨肉瘤耐药有关。在这些信号通路中，HSPA5编码的葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的高表达与治疗后宿主的不良预后和抗肿瘤治疗的耐药性有关，GRP78又称免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip），属热休克蛋白70家族的一员，以分子伴侣的形式位于内质网上确保蛋白质的正确折叠以及对分泌蛋白和膜蛋白进行翻译后修饰。然而，GRP78促进恶性进展的确切分子机制仍不明确。临床上也需要探讨如何靶向GRP78，以提高肿瘤化疗的效果。转录因子4（ATF4）作为综合应激反应通路的中枢调控因子，可触发参与细胞生存和死亡的下游靶基因群的转录。其中，编码CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）的同源蛋白CHOP的DNA损伤诱导转录本3（DNA damage inducible transcript 3，DDIT3）被认为与ATF4一起通过增加蛋白合成来加强对氧化应激诱导的内质网应激和凋亡的反应。. 本研究利用基因干预手段、实时荧光定量PCR、免疫印迹、报告基因、组织病理学检查、免疫荧光、流式细胞术等分子生物学手段，在体内和体外探索了骨肉瘤化疗耐药形成的机制，并从天然产物中发现能克服骨肉瘤化疗耐药的活性单体，证明这些单体可通过调控内质网应激相关蛋白，增加骨肉瘤对化疗药物的敏感性。本研究不仅在耐药骨肉瘤上进行天然产物增敏检测，还使用人乳腺癌耐药细胞和人白血病耐药细胞对天然活性逆转剂进行了作用机理研究。此外，本研究在对天然来源癌症耐药逆转剂进行筛选的同时，发现了一些具有细胞毒性的单体，并发现其能引发肝癌细胞自噬，诱导细胞凋亡。