水稻显性半矮秆突变基因Sdt97的图位克隆与功能验证

在前期研究工作中，利用所构建的新型近等基因系类型群体-剩余杂合系定位群体，我们将显性半矮秆突变基因 Sdt97 定位于水稻第六号染色体长臂端的两个STS标记TX5与N6之间，TX5与N6之间的物理距离为 118 kb 。在最近的研究工作中，我们在标记TX5与N6之间又发展了16个新的SNP标记；同时，在此区间之内，我们还筛选到了33株隐性高秆交换单株。.本项研究系在上述研究的基础之上开展的，目的在于①进一步缩小Sdt97定位区间，推定候选基因，从而实现Sdt97基因的图位克隆；②对比分析高秆野生型与半矮秆突变体植株cDNA、DNA序列资料,探索 Sdt97 突变机理；③通过RT-PCR,qRT-PCR 等分析手段，研究突变基因 Sdt97 的时空表达模式；④采用绿色荧光蛋白标记技术，研究Sdt97的细胞、亚细胞定位情况。

在Sdt97 定位研究中，我们采用籼粳杂交选育高代重组自交系的方法，选育了一个近等基因系类型分离群体-F6:7剩余杂合系，成功地将Sdt97定位于水稻第六染色体长臂端区间大小约60kb的SNP标记N6与N16之间。利用生物信息学方法，对定位区间内候选基因进行ORF预测和测序分析，先后排除了其中的序列无差别和多拷贝基因，最终将LOC_Os06g44050确定为突变基因Sdt97的候选基因。分析基因LOC_Os06g44050测序结果发现，1）在起始密码子前第277个碱基位置的启动子区域，高秆野生型的碱基为G，矮秆突变体突变成了C，发生了一个碱基突变；2）在矮秆突变体和高秆野生型中，均发生了一个342bp大小的DNA片断删除，删除片断发生于基因LOC_Os06g44050 DNA序列546-887bp及CDS的194-535bp之间。为确认启动子突变与半矮秆突变之间的相关性,及对下游基因转录的影响,我们对不同生长发育时期的半矮秆突变体和高秆野生型基因LOC_Os06g44050表达量进行qRT-PCR分析。结果表明 1）苗期，高秆野生型与半矮秆突变体基因LOC_Os06g44050表达量大致相当，其⊿⊿ct=0.12；2）分蘖期，半矮秆突变体基因LOC_Os06g44050表达量明显升高，达到了高秆野生型表达量的4倍以上，其⊿⊿ct=-2.10，半矮秆突变体表现生长繁茂，分蘖速度加快；3）拔节期，高秆野生型基因LOC_Os06g44050表达量明显升高，反向达到了矮秆突变体的4倍以上，其⊿⊿ct=2.04，高秆野生型植株表现生长速度加快，株高明显增加；4）乳熟及其后时期，高秆野生型基因LOC_Os06g44050表达量仍然维持在较高水平，但其与半矮秆突变体差别不大，仅略高而已，其⊿⊿ct=0.33。以上实验结果证实了，发生于启动子碱基序列的原始突变，通过基因转录途径，对基因LOC_Os06g44050表达量和表达模式产生影响,最终产生了植株矮化的突变表型。利用Gateway转基因系统, 我们还构建若干套转基因表达载体,对突变基因 LOC_Os06g44050开展了转基因功能补偿试验，初步获得了显性半矮秆突变体的类似表型。