基于珍珠贝基因组测序分析的珍珠形成矿化关键基因和蛋白质的研究

Although there has been great progress in the molecular researches on the shell and pearl formation, the crucial genes and proteins which controlled mineralization and the molecular mechanism which regulated the conversion of different crystalline were kept unknown. Based on de novo genome sequencing of pearl oyster Pinctada martensii, the aims of this study were to deliberate the differential expression of functional genes in the process of the pearl sac formation and clone the crucial genes that control the mineralization using RNA-seq technology and bioinformatics method through building the RNA expression library of different stages of pearl sac formation. Meanwhile, we will clarify the species, structure and functions of the proteins that are involved in the mineralization by comparing the proteins in the pearl sac fluid using proteome profiling and isobaric tags for relative and absolute quantitative (iTRAQ) technology. Furthermore, we will discovery and confirm the correspondence of the crucial genes and proteins that control the mineralization and crystalline style following the pearl sac formation by combining the RNA expression library and proteome profiling, and finally explain the molecular regulation mechanism of pearl formation.

虽然对贝壳和珍珠形成的相关分子生物学研究取得了很大进展，但矿化的关键基因和蛋白质并不清楚，不同结晶转换的分子调控机制尚未明了。本项目拟在对马氏珠母贝（Pinctada martensii）基因组测序研究的基础上，通过不同发育时期珍珠囊RNA表达谱的构建，应用RNA高通量测序（RNA-seq）技术结合生物信息学分析，揭示珍珠囊功能基因的差异表达，发现并克隆矿化关键基因。采用基于质谱的蛋白质全谱和同重同位素相对与绝对定量（iTRAQ）技术，对不同发育阶段的珍珠囊液蛋白质进行比较分析，阐明直接参与矿化作用的蛋白质种类、结构及功能。将RNA表达谱与蛋白质组学两方面的研究相关联，发现并确认随珍珠囊发育表达的矿化关键基因与结晶蛋白质的对应关系，以期最终揭示珍珠形成的分子调控机制。

虽然对贝壳和珍珠形成的相关分子生物学研究取得了很大进展，但矿化的关键基因并不清楚。本项目在对马氏珠母贝（Pinctada martensii）基因组测序分析的基础上，通过对不同发育阶段的珍珠囊和珍珠囊液蛋白质进行转录组和蛋白质组比较分析，发现了珍珠形成矿化关键基因：Collagen VI（COLVI）、类-α-2巨球蛋白（α2M-like）基因、几丁质结合蛋白（chitin-binding protein，CBP）和四个没有功能注释的新基因（Pm-RRMP，Pm-GRMP，Pm-PRMP，Pm-SRMP），并对他们进行了序列验证和功能分析。结果如下：COLVI基因表达沉默后，贝壳珍珠层内表面超微结构出现不同程度的紊乱，棱柱层结构正常，证明COLVI参与马氏珠母贝贝壳珍珠质的形成。进化分析表明高等生物骨形成等矿化过程中发挥关键作用的Col1/2/4是由ColVI分化形成，说明COLVI是一种古老的胶原类型。α2M-like基因沉默后，贝壳内表面珍珠层和棱柱层超微结构均发生变化，结晶体均形状不规则，排列疏松，甚至有溶解消失的情况出现，而正常的珍珠层和棱柱层晶体排列规则且紧密，推测α2M-like可能参与了贝壳棱柱层和珍珠层的生物矿化过程。CBP基因沉默后导致贝壳内表面的珍珠层结晶形态不完整，片层状板块细碎，晶体排列间隙大，局部有洞穴存在的现象，而正常的珍珠层晶体则是规则排列，各板块晶体排列紧密且界限清晰，因此推断CBP是贝壳珍珠层有机质的重要组分。四个没有功能注释的新基因（Pm-RRMP，Pm-GRMP，Pm-PRMP，Pm-SRMP）中Pm-RRMP在边缘膜中呈现高表达，说明该基因可能与贝壳棱柱层形成相关，另外3个基因的mRNA都主要在外套膜中央区及珍珠囊中呈现高表达，可能参与珍珠层的矿化过程，而RNA干扰后目的基因在外套膜中央区的表达量显著下降，结合SEM观察贝壳内表面的超微结构发现，珍珠层结构排列不规则，片层之间界限模糊，有融合的趋势，说明这4个基因在贝壳形成过程中起着重要作用。本研究发现了多个珍珠层形成相关和一个棱柱层形成相关的关键基因，为阐明贝类生物矿化机制奠定基础。