炔酰胺介导的硫肽键形成方法及其在蛋白质动态修饰中的应用研究

Proteins are large biomolecules which are essential parts of organisms and participate in virtually every process within cells. Their functionalities are usually dynamically controlled by reversible post-translational modifications. Among these numerous modifications, thioamide substitution, the site-specific introduction of a thioamide bond Ψ[CS-NH] to a peptide backbone by simple replacement of a carbonyl oxygen atom with an sp2 sulfur atom, constitutes one that causes minimal perturbation. It has been shown that thioamide substitution does not change the geometry of that particular amide bond, but confers different chemical and physical properties. Owing to these features, thioamide bonds have become a multifunctional probe for studying protein structure, folding, stability, function, and dynamics. However, exploration of the full potential of thioamide substitution has been hampered by insufficient synthetic strategies for site-specific introduction of thioamide bonds to peptide backbones. In this proposal, we attempt to develop a novel ynamide-mediated thioamide bond formation strategy with monothiocarboxylic acids as thioacylating reagent surrogates. With a good balance between activity and stability, α-thioacyloxyenamides formed from ynamide and monothiocarboxylic acids would allow us to incorporate a thioamide bond to peptide backbone site-specifically. If successful, this thioamide bond formation strategy will be applied for the chemical synthesis of thioamide-substituted proteins with the assistance of native chemical ligation. Finally, we’d like to study the effect of thioamide substitution on protein structure, stability, function, and dynamics with the thioamide-substituted chemokines CLL11 as the model protein.

一切生命活动都有赖于蛋白质功能的正确发挥，蛋白质的动态修饰对其功能的正常行使发挥着至关重要的作用。将普通肽键羰基氧原子替换成硫原子的硫肽键修饰是造成蛋白质组成变化最小的一种修饰方式。虽然硫肽键与普通肽键只有一个原子不同，但却展示出不同的化学和物理特性。因此，硫肽键被作为一种重要的化学生物学工具用来研究蛋白质结构和功能。硫肽键还可以原位转化回普通肽键，这一特性使其有望成为一种研究蛋白质动态修饰的理想工具。但是，由于缺乏精准高效的硫肽键构建方法，致使硫肽键修饰的应用潜力未能被充分发掘出来。本课题拟开发一种高效地定点构建硫肽键的新方法，并将其推广至硫代多肽的固相合成和蛋白质的硫肽键修饰中。然后将由固相合成得到的定点硫肽键修饰的多肽片段通过自然化学链接法引入到蛋白质中，从而实现蛋白质的精准硫肽键修饰。我们还将进一步以硫肽键修饰的趋化因子CCL11为模型蛋白质去探索硫肽键修饰对蛋白质结构和功能活性的动态影响。

一切生命活动都有赖于蛋白质功能的正确发挥，蛋白质的动态修饰对其功能的正常行使发挥着至关重要的作用。最新研究表明硫代酰胺修饰是一种新型的多肽和蛋白质翻译后修饰，与其它修饰相比是造成多肽和蛋白质组成变化最小的一种修饰方式。由于硫代酰胺键修饰的多肽和蛋白质难以获得，其生物学效应还不明确。在自然科学基金“生物大分子动态修饰与化学干预”重大研究计划（培育项目91853114）的支持下，基于我们课题组原创的炔酰胺类缩合试剂，我们发现了一种在多肽主链骨架上精准引入硫代酰胺键修饰的方法，解决了硫代酰胺键（硫肽键）修饰在多肽与蛋白质化学生物学研究领域的瓶颈问题。实现了多肽与蛋白质主链骨架的硫代酰胺键动态修饰。基本上完成了申请书中所提到的各项研究目标，并有一些新的发现和进展。总结如下：1.利用课题组原创的炔酰胺类缩合试剂与单硫代羧酸选择性加成，创造性地发现了新型硫酰化试剂，该试剂不仅可用于硫代二肽的合成，还可用于多肽主链骨架上硫代酰胺键的精准修饰；2.成功将该硫酰化试剂应用于硫代多肽的固相合成，实现了19种天然氨基酸（除His）的硫羰化和连续多个硫肽键取代多肽的固相合成；3.实现了Ala38和Lys56两种不同位点硫代酰胺键修饰片段的固相合成，完成了Ala38位点单硫代酰胺修饰CCL11的全合成，并开发了新型硫酯合成方法用于趋化因子CCL11硫酯片段的合成方法；并且发展了一种将硫代酰胺键转化为普通酰胺键的方法，实现了多肽硫代酰胺键的动态修饰；4.开发了硫酰化试剂在多肽C端修饰上的应用，实现了无消旋多肽C端硫代伯酰胺修饰；5.基于硫酰化试剂，实现硫羰基酯和二硫酯的合成；6.探索硫代羧酸与炔酰胺高选择合成硫酰化试剂过程中，发现了新型缩合试剂联烯酮缩合试剂；7.发现了生物相容的巯基与炔酰胺立体选择性β-加成反应，并据此化学成功发展了一种多肽与蛋白质的半胱氨酸精准修饰与标记方法。