重组地皮菜水应激蛋白Re-WSP1通过结合FZD抑制Wnt信号通路杀伤结肠癌细胞的分子机制研究

We first identified the water stress protein 1（WSP1） from Nostoc commune Vauch. and constructed Re-WSP1 by gene engineering. In colon cancer cells, when Wnt proteins bind to membrane surface receptors curl protein (FZD), the disheveled protein (Dvl) and glycogen synthase kinase 3 (GSK3-β) are activated, which resulted in the intracellular accumulation of β-catenin. Wnt pathway is abnormally activated. Previous studies demonstrated that Re-WSP1 induced colon cancer cell apoptosis, inhibited the activation of GSK3-β and Dvl, and reduced the expression quantity of β-catenin. Moreover, immunofluorescence results indicated that Re-WSP1 located in the cell membrane. It is speculated that Re-WSP1 kills colon cancer cells through inhibiting Wnt pathway via FZD. This study intends to investigate the mutual effect of Re-WSP1 and Fzd and its effect domains. Last but not lease, elucidating the mechanism how Re-WSP1 exert its tumor-repressive function would provide novel options for clinical colon cancer intervention.

本项目首次从地皮菜中分离鉴定出具有抗结肠癌活性的水应激蛋白1(WSP1)，并通过基因工程手段获得重组水应激蛋白（Re-WSP1, Gene bank序列号KF003026）。在结肠癌中Wnt蛋白与其膜表面受体卷曲蛋白（FZD）结合，激活FZD下游的蓬乱蛋白（Dvl）和糖原合成酶激酶-3（GSK3-β）导致β-catenin在胞内累积，Wnt信号通路异常激活。前期研究结果显示Re-WSP1能够诱导结肠癌细胞凋亡，抑制GSK3-β和Dvl活化，降低β-catenin表达量，且免疫荧光显示Re-WSP1的靶点为细胞膜蛋白。由此推测，Re-WSP1是通过与FZD结合抑制Wnt信号通路进而杀伤结肠癌细胞。本研究拟深入探讨Re-WSP1与FZD相互作用的分子机制及其效应结构域，阐明Re-WSP1/FZD对Wnt信号通路的调控机理，为结肠癌药物干预提供新的理论和应用依据。

结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其传统治疗方式是手术，但缺陷是易复发，且复发是造成结肠癌患者死亡的主要原因之一。目前结肠癌治疗一个发展趋势是靶向治疗，但进展缓慢，且明确的治疗靶点并不多，所以结肠癌的机制及药物治疗靶点需要进一步研究。.地皮菜学名为Nostoc commune Vauch.，是一种固氮蓝绿色藻类，其营养成份丰富，可作为一种美食，也可作药用。课题组前期研究中从地皮菜提取的天然水应激蛋白WSP1和利用基因工程技术重组表达的Re-WSP1均具有显著的抗结肠癌效应，但其抗结肠癌效应的分子机制并不清楚。本研究主要从以下几个方面探究Re-WSP1抗结肠癌的分子机制：.1、Re-WSP1对结肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的影响。利用western blot检测到Re-WSP1处理后结肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达量显著降低，进一步证明Re-WSP1抑制了Wnt/β-catenin信号通路。.2、Re-WSP1抗结肠癌效应的分子机制。通过免疫荧光共定位发现Re-WSP1作用于结肠癌细胞膜表面，分离细胞膜蛋白并结合质谱鉴定筛选Re-WSP1作用于结肠癌细胞的膜靶点，His-Pull down、western blot及抗体封堵实验结果表明FZD为Re-WSP1抗结肠癌效应的作用靶点。.3、Re-WSP1活性片段的筛选。分析预测Re-WSP1的序列和功能结构域，利用基因工程技术构建并表达Re-WSP1的截短体WSP1-1、WSP1-2和WSP1-3，通过MTT和流式细胞术检测结果发现WSP1-1的活性明显高于全长及其它两个截短体，表明WSP1-1为WSP1发挥功能的活性片段。.4、Re-WSP1裸鼠体内抑制结肠癌的作用。建立裸鼠异种移植瘤模型，并给予Re-WSP1，结果显示，与对照组相比较，Re-WSP1能够显著抑制移植瘤细胞的增殖。. 综上所述， Re-WSP1在裸鼠体内能够有效地抑制结肠癌的增殖。Re-WSP1通过靶向作用于Wnt/β-catenin信号通路中的七次跨膜蛋白受体FZD抑制Wnt/β-catenin信号通路从而发挥抗结肠癌效，其生物学效应片段为WSP1-1。本研究为结肠癌的诊断和治疗提供有效的生物靶点，为结肠癌的药物干预提供新的理论和应用基础。