基于目标诱导链释放的高灵敏度信号放大技术的构建及食品中毒素检测研究

A novel signal amplified strategy based on target-induced strand release will be developed for the ultrasensitive detection of food toxins. The new signal amplified strategy, which one target produces multiple signal units, based on target-induced strand release coupling cleavage of nicking endonuclease will be firstly fabricated. This signal amplified strategy can solve the scientific problems of coefficient of signal amplification being restricted by one-to-one recognition reaction between target and signal unit and the needing of specific recognition of target aptamer in nicking endonuclease signal amplification. It also can enrich and develop the theory of signal amplification. The chemiluminescent probe will be prepared with gold nanoparticles, N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol (ABEI), recognition and occupation DNA. The Ochratoxin A (OTA), choosed as the interested target, will be sensitively and selectively detected with the developed signal amplified strategy combined with the magnetic bead capturing and separation. The feasibility and reliability of the developed method will be evaluated by the determination of OTA concentrations in agricultural commodities and HPLC controlled experiment. Generalization of this detection method for the others foodborne pathogens will also be studied. This study will provide new and effective design idea and experimental basis for high sensitive food safety determination.

本课题拟开展基于目标诱导链释放的高灵敏度信号放大技术的构建及食品中毒素检测研究。课题拟利用目标诱导链释放和切口酶酶切作用，建立一个目标物产生多个信号单元的信号放大新技术，解决现有分析测定技术中信号放大倍数受"一对一化学计量识别"和酶切循环放大中目标物的适体需要特异性位点限制的科学问题，丰富和发展信号放大的理论基础；并以功能化的磁性微珠为捕获和分离载体，以负载ABEI（N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺）、识别作用和占位作用的DNA功能化化学发光纳米粒子为探针，以食品中毒素- - 赭曲霉毒素A为模式分析测定对象构建高灵敏度和高选择性食品中毒素的分析测定新方法。对实际样品中赭曲霉毒素A进行测定，利用色谱标准方法对照等对新方法进行评价。对建立的分析测定新方法进行拓展，将其发展成为一种共性检测技术，初步应用于其他食源性致病菌的检测。为高灵敏度食品安全检测提供有效的设计思路及实验依据。

建立灵敏度高、特异性强的毒素检测方法对食品卫生安全和广大人民身体健康具有重要理论意义和实用价值。本项目按原计划完成了所有的研究内容，主要进行了以下几个方面的研究工作，建立了四种食品中毒素和食源性致病菌测定新方法。首先，利用目标诱导链释放和切口酶酶切作用，建立了一个目标物产生多个信号单元的信号放大新技术，解决了现有分析测定技术中信号放大倍数受“一对一化学计量识别”和酶切循环放大中目标物的适体需要特异性位点限制的科学问题，丰富和发展了信号放大的理论基础；并利用功能化的磁性微珠FMB1和FMB2，结合DNA聚合酶聚合作用和Nb.BbvCI切口酶酶切作用耦合的循环技术，以化学发光纳米粒子为探针构建高灵敏度化学发光分析检测方法，并以赭曲霉毒素A为分析测定对象建立了食品中毒素检验的高灵敏度分析方法。检出限为3.0×10-13 g mL-1，循环信号放大倍率达2×103倍。所建立的方法和提出的测定思路为高效、准确、灵敏的赭曲霉毒素A分析测定提供有效的设计思路及实验依据。基于熵驱动分子开关和信号放大技术构建了电化学传感器检测沙门氏菌的新方法，检出限为13 CFU/mL。利用纳米粒子标记催化氧化还原循环信号放大技术构建了高灵敏度测定DNA及多巴胺的新方法。基于光致化学发光和发卡催化链增长技术测定T-2毒素的研究，检测限是3.2 nM。以电化学还原石墨烯和纳米金共沉淀修饰离子液体碳糊电极，并以金纳米粒子和硫堇的信号放大作用，建立了一种高灵敏度测定谷胱甘肽的新方法。通过静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，利用标记适体与羧基化碳纳米粒子非共价键自组装原理建立了一种化学发光适体传感器。并围绕新分析方法的构建开展了相关研究：以蔗糖转化酶为标记物，在蔗糖转化酶的作用下，蔗糖水解为葡萄糖，以血糖仪为检测仪器，实现非葡萄糖目标物的简便测定，分别建立了五种方法用于沙门氏菌、L-组氨酸、基质金属蛋白酶-2、多巴胺和前列腺抗原的测定。该项目的研究结果将为食品中毒素和食源性致病菌含量的测定提供新的分析方法和重要信息，对开发新型分析技术具有重要意义。