凝血因子IX R327I突变蛋白结构与功能的研究

本项目将对自行发现的导致重型血友病的F9基因R327I突变的蛋白结构与功能进行研究，同时探讨该突变所在的β折叠结构域的特异性功能。利用定点突变及重叠PCR法分别构建R327I, R327A点突变及FIX β折叠结构域功能缺失型（替换为FVIIβ折叠结构域）和FVII功能获得型(替换为FIXβ折叠结构域）表达质粒，分别转染COS1细胞，通过G418筛选稳定表达株并大量培养，免疫亲和吸附法分离、纯化各种突变体蛋白，用激活剂活化各种突变体蛋白并用SDS凝胶电泳法检测。通过同位素标记竞争法检测R327I、R327A、功能缺失型和功能获得性突变体蛋白与FVIIIa结合力，发色底物法检测各种FIX突变体蛋白对底物（FX）的激活力等研究，阐明R327I突变导致血友病B的分子发病机制和突变所在的β折叠结构域的功能。