HIF-1α通过调控焦亡提高脑卒中后BMSC移植存活率和疗效的机制研究

Bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) have become a new treatment for stroke,but the low survival rate of transplanted BMSC seriously affects its efficacy.HIF-1α is closely related to the survival rate of BMSC, but the exact mechanism is unknown. Our previous study found that HIF-1α could increase the survival rate of BMSC by regulating the AMPK signaling pathway. Pre-experimental studies showed that hypoxia-glucose deprivation (OGD) treatment could increase pyroptosis of BMSC and decreased survival rate, while up-regulation of HIF-1α or blocking of caspase-1 could inhibit the expression of caspase-1, IL-1β and IL-18，decrease BMSC pyroptosis and increase its survival rate. Based on these, we hypothesized that HIF-1α may increase the survival rate and efficacy of transplanted BMSC by regulating AMPK and inhibiting caspase-1-dependent pyroptosis. This study is to verify the effect and mechanism of HIF-1α on the pyroptosis and survival of BMSC by using lentiviral transfection, crispr/cas9 gene knockout and other methods in OGD model and a rat model of cerebral infarction. In vivo verification of the mechanism. The results will provide new experimental evidence for the use and improving efficacy of BMSC transplantation in the treatment of stroke.

骨髓间充质干细胞（BMSC）已成为脑卒中新的治疗手段，但移植的BMSC存活率低下严重影响其疗效。HIF-1α与BMSC的存活率密切相关，但具体机制未明。我们前期研究发现：HIF-1α可通过调控AMPK信号通路提高BMSC存活率。预实验显示：缺氧缺糖（OGD）处理可引起BMSC焦亡增多，存活率减少；而上调HIF-1α或阻断caspase-1，可抑制caspase-1、IL-1β、IL-18的表达，减少BMSC焦亡，提高其存活率。据此我们假设，HIF-1α可能通过调控AMPK，抑制caspase-1依赖的细胞焦亡，提高移植的BMSC存活率及其疗效。本研究拟在建立体外OGD模型，采用慢病毒转染、crispr/cas9基因敲除等方法，明确HIF-1α对BMSC焦亡和存活率的影响及机制；并建立脑梗死大鼠模型，进行上述机制的体内验证。研究结果将为采用BMSC移植治疗脑卒中并提高其疗效提供新的实验依据。

BMSC 因其有效修复脑组织的功效有望成为治疗缺血性脑卒中的重要临床手段。然而，BMSC脑内移植的成活率低成为限制其广泛应用的重要原因，具体机制尚不明确。目前研究证实HIF-1α对BMSC具有保护作用，移植入脑内的BMSC焦亡增多可能是BMSC存活率低的重要原因。本项目预实验表明，AMPK信号通路的下游分子NF-κB在焦亡相关分子NLRP3的调控中发挥重要作用。因此，本项目提出研究假设，HIF-1α可能通过调控NF-κB信号通路抑制焦亡提高脑卒中后BMSC移植存活率，进而改善其疗效。本研究首先从大鼠获取BMSC，用crispr/cas9及腺病毒感染分别获得敲除和上调HIF-1α的BMSC，并检测细胞表型及焦亡相关蛋白表达；其次，建立MCAO模型并移植BMSC，通过检测BMSC存活及观察大鼠行为功能，验证上调HIF-1α可提高BMSC移植存活率并改善BMSC的疗效；最后引入NLRP3、NF-κB抑制剂，检测细胞表型及相关蛋白表达情况，验证上调HIF-1α通过抑制NF-κB信号通路下调NLRP3，进而影响BMSC的生存率及焦亡。研究结果表明：1）与对照组BMSC相比，OGD模型组细胞生存率降低、焦亡升高、HIF-1α及焦亡相关蛋白表达升高、焦亡相关蛋白分泌增加；OGD模型基础上上调HIF-1α后，相较于对照组细胞生存率回升，焦亡减少，焦亡相关蛋白表达及分泌均减少。2）移植上调HIF-1α组大鼠BMSC相较于其对照组在第14天有更高的存活率；焦亡相关蛋白表达降低，血清中焦亡相关蛋白分泌减少；大鼠行为能力及认知障碍得到明显改善。3）NLRP3、NF-κB抑制剂组相较于敲除HIF-1α组BMSC生存率升高，焦亡降低，焦亡相关蛋白表达及分泌均减少。4）在OGD模型BMSC中NF-κB表达上升，且HIF-1α与NF-κB在细胞质中的相互作用增加；HIF-1α敲除组相较于对照组，NF-κB表达在细胞核中占比较大，且上调HIF-1α组的NF-κB在核中表达占比减少。研究结果证实：HIF-1α通过调控NF-κB的细胞定位抑制NLRP3的表达，减少BMSC焦亡，从而提高BMSC存活率，改善其疗效。研究结果将为采用BMSC移植治疗脑卒中并 提高其疗效提供新的实验依据。