柑桔黄龙病伴生细菌对亚洲韧皮杆菌体外培养的影响

柑桔黄龙病（HLB）是影响全世界柑桔产业安全的毁灭性病害，由韧皮部内生的难培养G-细菌（Cadidatus Liberibacter asiaticus）引起，目前尚无公认的人工培养成功的报导，严重阻碍柑桔黄龙病的基础研究和病害防治的深入开展。研究表明柑桔黄龙病菌与一些其它微生物有伴生现象，本研究拟通过分析柑桔内生菌区系，筛选柑桔黄龙病菌伴生的微生物种类，进而探索柑桔黄龙病菌培养新途径，并利用实时荧光PCR动态检测靶标微生物的增殖。研究将构建柑桔内生菌16SrRNA基因文库，明确可培养原核生物的优势菌群，探索柑桔黄龙病菌与伴生菌的生态互作关系，建立黄龙病菌半组合协同共培养体系，实现病菌的体外培养并完成柯赫氏证病，为病原菌生物学研究、致病机理探索及防控策略制定提供理论基础和实验材料。

【研究背景】柑桔是世界第一大水果，柑桔黄龙病（Huanglongbing，HLB）是柑桔产业的一种毁灭性病害，全世界候选韧皮部杆菌属（4种），我国主要由亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, Ca. Las)引起。因最近美国农部韧皮部杆菌人工培养的研究报道（Scheler，2008）未能被国内外同行重复验证，至今没有获得公认的纯培养，成为严重限制柑桔黄龙病病原学和致病机理研究的共性技术难题。解决问题的关键在于摆脱纯培养的误区，找出传代培养难的成因，探索内生细菌荐的互作关系。【研究目标】本基金项目旨在以病/健黄龙病寄主组织和传病木虱为培养材料，通过分析植物源或虫媒寄主体内伴生微生物的多样性及优势菌群，寻找Ca. Las相关的功能性内生细菌，建立共培养体系并开展相互作用研究。.【研究成果】（1）利用兼性厌氧培养、基于16S rDNA的PCR－RFLP、PCR－DGGE结合的方法，对黄龙病芸香科与非芸香科寄主（柑桔、九里香、黄皮和长春花）病、健组织以及柑桔木虱的内生细菌多样性进行了系统分析和菌种鉴定，从韧皮部中分离纯化124个伴生性内生细菌。发现病、健组织内生细菌的种类和丰度差异明显，罹病寄主内生菌群结构改变，对病原菌的生长产生不同影响。（2）明确其中可培养优势菌群：柑桔为微杆菌属，短小杆菌属、沙雷氏菌属和芽孢杆菌属；长春花有葡萄球菌属；短小杆菌属、鞘胺醇单胞菌属和芽孢杆菌属；九里香为芽孢杆菌属和肠杆菌属；黄皮中为假单胞菌属、泛菌属和不动杆菌；亚洲柑桔木虱（ACP）体内获得10属、14种可培养细菌33株，葡萄球菌属、沙门氏杆菌属、克雷伯氏杆菌属为优势菌群。柑桔木虱基因测序的未培养优势菌群包括3种内共生菌、合胞体共生菌以及亚洲韧皮部杆菌；而柑桔、九里香中均为沙雷氏菌属。（3）利用微生态学特性鉴定出对HLB病原菌生长有抑制性、促生性的功能性菌株11株，其中低菌量九里香富含淀粉水解能力的抑制性功能菌株具有病害防控潜力。基于优化培养体系和条件以及靶标细菌EMA－qPCR活体动态检测方法，建立符合原生态的病原菌+伴生菌的共培养体系，初步实现黄龙病菌的共培养和成倍增长并完成柯赫氏验证。【科学意义】项目完成为黄龙病菌共培养及互作分析提供科学的测试平台和高效检测方法。将推动黄龙病病原菌的基础研究并为病害防治开辟新途径。