多色荧光型RNA适体分子定向进化及其在细胞内RNA成像应用

RNA is a biological macromolecule with a diverse array of important functions. Its biological behaviors such as subcellular localization and dynamic trafficking are closely related to biological metabolism, cell differentiation and many diseases. Real time imaging of RNA in living cells can provide direct evidence on RNA functions and essential information for elucidation the functional mechanisms of RNA. However, current RNA imaging techniques still have issues such as single color imaging. Thus, there is a great demand to develop a novel multi-color fluorescent RNA imaging tool. In this proposed project, based on previously obtained JX1 RNA aptamer, we will carry out molecular directed evolution to select a more sensitive and specific JX1-super RNA aptamer. Based on its different ligand derivatives, this aptamer can act as a novel multi functional RNA tags for in vivo RNA imaging, in vitro RNA fluorescent labeling and in vitro RNA purification. In the aspect of RNA imaging, JX1-super RNA could be employed as a versatile RNA imaging technique for RNA imaging in E. coli, yeast and mammalian cells, by using flexible multi-color fluorescent ligands. Our research will provide a novel tool and technique for RNA studies and promote the deeply understanding the biological functions of RNA.

RNA是具有多种重要功能的生物大分子，其在细胞内定位、转运等活动与生物代谢、细胞分化以及多种疾病密切相关。对细胞内RNA动态成像可为RNA功能研究提供直接证据，是分析阐释RNA作用机制的关键数据。然而，目前RNA细胞内成像技术还存在成像标签颜色单一等问题，迫切需要发展出新型多色荧光RNA成像工具。在本项目中，我们基于前期工作获得的JX1 RNA适体，利用分子定向进化技术筛选灵敏度更高、特异性更强的RNA适体（JX1-super）。该适体可依据其配体衍生物不同而展示出细胞内RNA成像、体外荧光标记以及RNA纯化等功能，是一种新型多功能RNA标签。在细胞内RNA成像方面，JX1-super根据研究需求可灵活选择多种荧光颜色配体，能够在细菌、酵母和动物细胞内建立一种通用性RNA分子成像方法，为RNA细胞内功能研究提供新的分子工具和技术手段，对深刻理解RNA生物学功能起到积极的推动与促进作用。

RNA在生物体内承担多种重要功能。在细胞内，RNA折叠、识别、定位及转运能够调控多种生物代谢、细胞分化以及组织发育，并与遗传、代谢甚至肿瘤疾病密切相关。对细胞内RNA动态成像可为RNA功能研究提供直接证据，是鉴定、分析和阐释RNA作用机制的关键数据。然而，目前RNA细胞内成像技术还面临成像标签颜色单一等问题，迫切需要发展出新型多色荧光RNA成像工具。本项目以前期工作获得的JX1 RNA适体为基础，利用分子定向进化技术及从头筛选技术分别获得了结合力更强、特异性高的RNA适体 (JX-DE3和JX-DN6)，并鉴定了JX-DE3 RNA在大肠杆菌内成像，为RNA细胞内功能研究提供新的分子工具和技术手段。此外，在本项目经费支持下，还创建了基于G-四联体和DFHBI的新DNA荧光标记法；利用可识别荧光分子的类手枪脱氧核酶构建了铜离子、葡萄糖传感器；并将I-R3脱氧核酶应用于体外筛选的单双链分离，以及构建了以荧光型RNA为信号的锌离子传感器，为体外筛选和生物分析提供了有价值的技术方法。