拟茎点霉合成松脂醇二葡萄糖苷的糖基化酶性质表征与基因克隆

Pinoresinol diglucopyranoside ((+)1- pinoresinol 4,4′-di-O-β-D-glucopyranoside, PDG) (up to 4 g/L)is natural product having multiple functional activities of anticancer, antihypertension, and preventing osteoporosis. Currently, the occurrenc of PDG is only reported in few plants with homology of medicine and food at low content. In our previous researches, we obtained a PDG-producing strain of Phomopsis sp. XP-1 from the endophytic fungi of Eucommia ulmoides Oliv.. It shows high production of PDG (up to 4 g/L) in liquid fermentation. This revealed the exists of microbial PDG biosythesis pathway and the key enzyme of glycosyltransferase for PDG biosynthesis. There is a great significance for developing microbial production of PDG in food processing.In our application, the glycosyltransferase involving in PDG biosynthesis will be extracted and purified from Phomopsis sp. XP-1, and cloning of the coding gene will be carried out, as well as analysis on the molecular properties and enzymatic characteristics. Methods of precipitation with ammonia sulfate, column chromatography, gel filtration will be used for enzyme purification, besides of fast protein liquid chromatography (AKTA FPLC). Terminal amino acid sequence of the enzyme will be analyzed and degenerate primers be designed on the basis of the result. Whole gene sequence of the enzyme will be obtained through construction of RACE cDNA library, PCR and RACE,and then be cloned in E. coli and expressed in yeast. The expressed product will be purified to analyze the enzymatic characteristics,especially the substrates, products and reaction emchanism related to PDG biosynthesis and explore the biosynthesis pathway of PDG in the strain. It is hopeful to provide basic results for discovering the whole PDG biosynthesis pathway in the strain and theory evidence for metabolic engineering of microbial production. This project will also provide consults for other microbial PDG synthesis pathway study.

松脂醇二葡萄糖苷（简称PDG）是具有抗癌、降血压、预防骨质疏松等多种功能的天然产物，存在于少数药食同源性植物中，微生物合成PDG对其高效获得与加工利用有重要的实际意义。申请人前期发现了一株高产PDG（可达4 g/L）的拟茎点霉，揭示了微生物PDG合成途径及其关键性糖基化酶的存在。项目以此菌为材料，通过硫酸铵沉淀、柱层析、凝胶过滤和AKTA FPLC对参与PDG合成的糖基化酶进行分离纯化，分析其末端氨基酸序列，设计简并引物；在构建RACE cDNA文库的基础上，通过PCR扩增和RACE技术获取该酶的全长基因，并对其进行克隆和真核表达；分离纯化表达产物，研究其酶学特性，分析其在PDG合成途径中的作用底物、产物及反应机制，探索该菌的PDG合成途径。项目实施可为该菌中PDG合成途径的全面研究奠定基础，为微生物合成PDG的代谢工程改造提供理论依据，为其它微生物中PDG合成途径研究提供参考。

总体而言，通过项目研究， 确定了拟茎点霉合成PDG的关键步骤，发表SCI论文3篇，授权发明专利1项，达到预期目标。解决了关键科学问题如下：.（1）明确了PDG合成途径中糖基化位点。.糖基化的作用底物可以是松伯醇、松脂醇，能够催化松脂醇为二糖苷（PDG）和单糖苷（PMG），但催化这两个反应的酶不是同一个酶；催化松伯醇转化为松伯苷；菌种同时含有催化PDG和PMG水解为松脂醇、松伯苷为松伯醇的酶；以及催化两分子松伯醇聚合为松脂醇的酶类，但是不含催化两分子松伯苷聚合为PDG的酶类。确定PDG的合成前体是松脂醇，两分子葡萄糖是同时加上，且由一种特殊的糖基化酶催化完成。.（2）获得了糖基化酶的编码基因.基于基因组和转录组分析结果，以及分离纯化所得酶的N-末端氨基酸序列，确定了参与PDG合成的一种糖基转移酶编码基因。同时，对其中的4CL和催化松伯醇转化为松脂醇的酶编码基因进行了分析与克隆。.（3）明确了糖基化酶的酶学特性.在分离纯化酶的基础上，重点研究了催化松脂醇单葡萄糖苷形成的糖基转移酶和催化糖苷水解的糖苷酶的底物特异性、作用条件等酶学特性，确定了该菌合成PDG的关键步骤。.（4）构建了利用该菌的静息细胞和冻干细胞转化葡萄糖生成松脂醇、PMG和PDG的反应体系，为项目的顺利实施奠定了重要的方法学基础。.（5）建立了同时定性、定量检测多种代谢途径中间产物及终产物的方法，实现了肉桂酸、对香豆酸、松伯苷、松伯醇、松脂醇、松脂醇单糖苷、松脂醇二葡萄糖苷等多个中间产物和终产物的同时检测为项目的顺利实施奠定了重要的方法学基础。.（6）通过底物饲喂实验，确定了代谢途径中的物质流向。.通过液质联用和同位素标记示踪法，分析了该菌在合成PDG时的物质代谢流程，揭示其代谢途径中的物质流向依次为：葡萄糖→苯丙氨酸→肉桂酸→香豆酸→咖啡酸→阿魏酸→→松伯醇→松脂醇→松脂醇单葡萄糖苷或者松脂醇二葡萄糖苷。.（7）培养条件对该菌合成代谢产物种类与产量的影响.考察了该菌在不同天然培养基中合成PDG的能力，揭示其在绿豆中的PDG产量最大，并发现绿豆多糖是促进该菌合成PDG的主要成分；考察了不同的单糖种类对该菌合成PDG的影响，发现所用单糖的种类不同，所得产物的种类和产量不同，鼠李糖抑制PDG合成，葡萄糖能够PDG合成，但是过量葡萄糖有抑制作用。