多病种联合基因敲除小鼠模型筛选肝肾阴虚证标识基因及蛋白研究

In our Previous work, We use gene microarray to detect gene expression profiles of peripheral blood mononuclear cells in hepatocellular carcionma patients with syndrome of kidney and liver yin asthenia.by compared with the gene-ontology and pathway and co-expression network which participated in Differentially expressed genes， we found 18 genes which have important expression status in liver cancer patients with syndrome of kidney and liver yin asthenia. To further verify the results and look for a small number genes, these genes may have constant expression in syndrome of kidney and liver yin asthenia，we also call them "Identify genes" . This study by expanding the sample size of patients with hepatocellular carcinoma, according to theory of Chinese medicine, "Different diseases can treated in the same way" , select the high blood pressure, diabetes patients with liver and kidney syndrome, respectively, Observation the mRNA and protein expression in significant differences genes which were screened in early gene chip；Use of multiple diseases common screening out difference express of gene construct diagnosis model,select specific high differences in gene diagnostic model to construct the gene knockout mouse model, Selection liu wei di huang wan ball to knockout mice, by observing the gavage mice before and after general status and related biochemical changes; Analysis knockout the relationshi between gene mRNA and protein change direction with syndrome of kidney and liver yin asthenia,try to find one or several identify gene and protein which really belong to the syndrome of kidney and liver yin asthenia。

我们前期研究发现：肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证肝癌患者外周血淋巴细胞中存在差异基因表达，分析基因共表达网络，扩大样本量验证后，获得18个在肝癌肝肾阴虚证中具有显著性差异表达的基因，其中部分基因功能与肿瘤相关。为了观察这些基因在其它疾病中的表达，并试图寻找出数目不多、但能在不同疾病肝肾阴虚证中稳定出现表达变化的"标识"基因。本研究依据中医"异病同治"原理，选取无其它疾病背景的高血压、糖尿病肝肾阴虚证患者外周血淋巴细胞作为检测对象，观察其在前期基因芯片中筛选出的显著性差异基因的mRNA和蛋白表达；利用多病种共同筛选出的差异基因构建诊断模型，选取特异度高的差异基因构建不同疾病同一基因敲除小鼠模型,选用六味地黄丸给小鼠灌胃，通过分析灌胃前后小鼠一般状态及相关生化指标的改变，结合被敲除基因在患者外周血中的改变方向和程度共同探讨其与肝肾阴虚证之间关系，试图发现一个或几个真正属于肝肾阴虚证的标识基因及蛋白。

我们前期研究发现：肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证肝癌患者外周血单个核细胞中存在18个差异基因表达，其中部分基因功能与肿瘤相关。为了观察这些基因在其它疾病中的表达，并试图寻找出数目不多、但能在不同疾病肝肾阴虚证中稳定出现表达变化的“标识”基因。本研究依据中医“异病同治”原理，选取无其它疾病背景的肝癌、高血压、糖尿病肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞作为检测对象，共纳入原发性肝癌患者50名、高血压患者94名和2型糖尿病患者100名，分为肝肾阴虚组和非肝肾阴虚组。在肝癌患者中，18个mRNA在肝肾阴虚证组和非肝肾阴虚证组均存在差异表达。而在糖尿病患者中，只有MLH3在肝肾阴虚证组中的表达低与非肝肾阴虚证组。高血压患者中，肝肾阴虚证组MLH3表达较非肝肾阴虚组减少，CD55表达较非肝肾阴虚组增加。选择在三种疾病中均具有显著性差异表达的基因MLH3，绘制ROC曲线，90%的肝癌肝肾阴虚患者，77%的高血压肝肾阴虚患者和81%的糖尿病肝肾阴虚患者MLH3表达降低。根据该结果，构建MLH3敲除小鼠模型，Western blot检测，与野生型（WT）小鼠比较，MlH3(-/-)小鼠的MLH3表达明显减少，而MlH3(-/+)小鼠则无明显改变。MlH3(-/-)小鼠和MlH3(-/+)小鼠与WT小鼠比较，均出现肛温偏高、体重轻微减轻、毛色发黄、光泽减少、小便发黄的表现。给予六味地黄丸治疗后，MlH3(-/+)小鼠的上述症状得到部分改善，而MlH3(-/-)小鼠则无明显改善。在MlH3(-/+)小鼠上建立肝癌、高血压、糖尿病的疾病模型。与WT小鼠比较，各种疾病的MlH3(-/-)小鼠和MlH3(-/+)小鼠均表现为cAMP水平下降，E2/T比例升高；给予六味地黄丸治疗后，MlH3(-/+)小鼠cAMP水平升高，E2/T比例下降；而MlH3(-/-)小鼠则无明显变化。通过以上研究，我们认为，MLH3降低是不同疾病肝肾阴虚证的特征表现之一，MLH3是肝肾阴虚证的标识基因之一。然而，证候是一组中医症状表现的集合，因此理论上它所涉及的基因也应该是多个的，由于疾病本身的复杂性和本研究设计的缺陷，我们未能发现两个以上的基因的变化是一个遗憾。更重要的是，MLH3能否最终成为肝肾阴虚证的标识基因应用于临床还需要进一步论证。