基于染色体片段代换系的黄瓜抗白粉病基因精细定位及克隆研究

白粉病是黄瓜（Cucumis sativus L.）生产上的主要病害,随着设施栽培面积的不断扩大，其危害愈发严重。分离鉴定抗病基因，利用现代分子生物技术手段创新种质，选育高抗白粉病品种是克服黄瓜白粉病危害、生产优质黄瓜的有效途经。本项目在对黄瓜抗白粉病QTL初步定位的基础上，利用选育的白粉病抗性近等基因系培育覆盖抗性QTL区域的染色体片段代换系，进而利用抗白粉病片段代换系构建目标QTL次级群体。在此基础上借助黄瓜基因组SSR标记及特异STS、CAPs等标记进行抗白粉病QTL精细定位，将目标QTL区域进一步缩小。然后，结合黄瓜基因组信息和生物信息学方法确定该区域内的候选基因，将具有抗病结构域特征的序列确定为最有可能的候选基因；再通过RNA干扰结合农杆菌介导的瞬时表达技术对候选基因进行功能验证。研究结果不仅对于明确黄瓜抗白粉病机制具有重要意义，而且是黄瓜白粉病抗性种质创新的重要理论和技术支撑。

本项目以黄瓜高抗白粉病品系Jin5-508和易感品系D8为亲本，通过杂交、连续回交12代，并利用分子标记辅助选择，获得长度0.7 cM来自Jin5-508的单片段导入系SSSL0.7。利用SSSL0.7与高感白粉病D8为亲本构建次级F2分离群体3600株，并对其进行抗性表型鉴定及抗病重组鉴定；依据双亲重测序结果开发SNP-dCAPs标记，最终将候选区域缩短至41.1kb，共含有8个候选基因；qRT-PCR结果表明Csa1M064780.1 和Csa1M064790.1可能是黄瓜抗白粉病的关键基因。将上述两个候选基因连接至含有绿色荧光蛋白GFP的载体中，利用基因枪法将基因转化到洋葱表皮细胞，通过荧光显微镜在498 nm蓝光激发下观察绿色荧光蛋白的表达，发现Csa1M064780.1位于细胞核和细胞膜上，Csa1M064790.1仅位于细胞膜上。此外，对各黄瓜抗白粉病片段代换系抗白粉病能力的田间观察发现，除SSSL0.7高抗白粉病外，另一片段代换系SSL508-28的病情指数极显著低于SSSL0.7，与抗白粉病供体亲本Jin5-508间差异不显著。该结果表明：SSL508-28中应存在异于SSSL0.7的抗白粉病基因，且抗病表型稳定。通过重测序在SSL508-28和D8间共发现94个基因具有非同义突变基因，并在chr5染色体上检测到一个导入的片段，位于黄瓜参考基因组Chr5的16676542-23484079间，该区域内共有856个基因。为了更全面了解接种白粉菌后片段代换系SSL508-28与受体亲本D8全基因组在转录水平上的差异，以高感白粉病品种D8和抗白粉病片段代换系SSL508-28为材料，研究接种白粉菌48h后两者的差异表达基因。D8在接种白粉病病菌48h与对照间共有1284个差异基因，其中819个基因上调表达，429个基因下调表达；SSL508-28在接种白粉病病菌48h与对照间共有1305个差异基因，其中705个基因上调表达，620个基因下调表达；12个基因在SSL508-28中上调表达，而在D8中下调表达；76个基因在SSL508-28中下调表达，而在D8中上调表达。上述结果为今后创新黄瓜抗白粉病种质以及选育黄瓜高抗白粉病新品种奠定基础。