用高通量测序和宏转录组学方法研究广西甘蔗内生功能固氮菌的多样性

少施氮肥，降低栽培成本同时又实现高产高糖，是甘蔗高效环保生产的根本要求。甘蔗能通过内生固氮菌固氮获得氮素，但目前还不知道哪些固氮菌是甘蔗固氮的主要贡献者及其在甘蔗体内的固氮位点。在前期工作的基础上，本项目拟用已建立的甘蔗联合固氮体系优化检测固氮菌在甘蔗茎内表达nifH的方法，用定量RT-PCR从在适合联合固氮条件下种植的25个甘蔗品种茎内检测nifH表达强度，用RT-PCR从nif高表达品种茎内扩增收集功能固氮菌的nifH转录组，利用nifH在进化上与16S rRNA基因的一致性，通过高通量测序和生物信息学解析广西甘蔗内生功能固氮菌的多样性，进而重新分离或从菌种库中选出与主要功能固氮菌同属的固氮菌，单独或混合接种nif高表达品种，用定量nifH RT-PCR和15N同位素稀释技术筛选出高效固氮体系，用原位杂交揭示功能固氮菌在甘蔗体内的固氮位点，为甘蔗低肥高效栽培奠定生物学基础。

甘蔗是世界上最重要的糖料和能源作物。甘蔗能通过内生固氮菌固氮获得氮素，利用这一特性可能减少氮肥施用。我国的蔗糖产量居世界第三位，其中广西的产糖量约占全国65%，但甘蔗生产成本居高不下，氮肥施用量严重偏高是重要原因之一。本项目用高通量测序和宏转录组学等方法研究了广西甘蔗内生及根际土壤中的功能固氮菌的多样性，首次证实Klebsiella variicola固氮菌和Raoultella属固氮菌与植物寄主联合固氮，Kosakonia属固氮菌与甘蔗联合固氮；鉴定了一个分类新种Enterobacter sacchari；系统分类了Klebsiella pneumonia姐妹种中的固氮菌，发现K. penumoniae低频固氮，K. quasipneumonia中频固氮，K. variicola是固氮种；测定了4个Klebsiella属固氮菌的全基因组序列，为理清Klebsiella属的系统分类地位和解析Klebsiella属固氮菌的遗传多样性和机会致病性奠定了基础；测定了7个Kosakonia属菌株的全基因组序列，为理清Kosakonia属成员的系统分类地位和解析Kosakonia属固氮菌的遗传多样性和与植物互作的机制奠定了基础；发现甘蔗根内和根际土壤的细菌和固氮菌的多样性指数的处理间差异因品种和作物类型的不同而有所不同，间作大豆可提高甘蔗根内和根际土壤的细菌和固氮菌多样性和数量；分离到一批新的固氮菌株，其中一些单独或混合接种甘蔗具有显著的促生作用。对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E接种甘蔗后的蛋白质组进行分析，共鉴定出差异蛋白质49个；克隆了DX120E的nifH、nifD和nifK基因，构建了原核表达载体。本研究所取得的成果为利用甘蔗生物固氮特性节肥减耗生产奠定了生物学和生物技术基础。