泛素连接酶RNF2通过与新型神经营养因子MANF相互作用介导神经的保护作用

E3 ubiquitin ligase RNF2 is a menber of polycomb group family (PcG). It plays an important role in embryonic development, tumorigenesis, and stem cell maintenance by monoubiquitinating histone H2A. It was reported that RNF2 was upregulated in the brain and retina of ischemic tolerance rats. Our preliminary study showed that overexpression of RNF2 reduced the endoplasmic reticulum stress-induced neural cell death. We also found RNF2 interacts with mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) detected by yeast two-hybrid assay. Therefore, we hypothesize that RNF2 may have a neuroprotective effect, and MANF may be involved in this process by interacting with RNF2. To test this hypothesis, we firstly observe the expression and distribution of RNF2 in the brain tissues of the ischemia-reperfusion rats; Secondly, we will observe the effects of RNF2 overexpression and knockdown on the morphology, proliferation, and apoptosis of neural cells simulated by ischemia and hypoxia in vitro; Thirdly, the interaction of RNF2 and MANF will be proved by Co-IP and pull-down; Finally, we will figure out whether the neuroprotective role of RNF2 is dependent on MANF expression. This study will verify the neuroprotection of RNF2 and clarify the relative mechanisms, which will shed a light on intervention of cerebral ischemia and other neurological disorders.

泛素连接酶RNF2是多梳家族（PcG）成员，主要功能是单泛素化组蛋白H2A，在胚胎发育、肿瘤发生和干细胞维持中发挥重要作用。有研究报道，在缺血耐受大鼠脑和视网膜中RNF2表达上调。我们的前期研究也发现，过表达RNF2能减少内质网应激诱导的神经细胞死亡，并且RNF2和神经营养因子MANF有相互作用，推测MANF可能参与了RNF2 的神经保护作用。为此，我们拟开展以下研究：检测RNF2在缺血再灌注损伤的大鼠脑组织中的表达和分布；在体外诱导神经细胞缺血缺氧，检测RNF2的表达与定位；过表达外源性RNF2和沉默内源性RNF2，观察缺血缺氧神经细胞的形态、增殖和凋亡的变化；用CoIP及Pull-down等方法验证RNF2与MANF的相互作用；进一步考察RNF2的神经保护作用是否依赖MANF的表达等。该研究结果可能为阐明RNF2的神经保护作用及其机制提供实验依据，也为脑缺血的治疗提供新的候选靶点。

泛素连接酶RNF2 是多梳家族（PcG）成员，主要功能是单泛素化组蛋白H2A， 在胚胎发育、肿瘤发生和干细胞维持中发挥重要作用。有研究报道，在缺血耐受大鼠脑和视网膜中RNF2 表达上调。我们的前期研究也发现，过表达RNF2 能减少内质网应激诱导的神经细胞死亡，并且RNF2 和神经营养因子MANF 有相互作用，推测MANF可能参与了RNF2 的神经保护作用。我们的研究阐明了以下科学问题：1.RNF2与MANF是否存在直接的相互作用？2.RNF2 在脑缺血损伤中上调表达的作用及意义。3.MANF是否参与了RNF2 的神经保护作用。本项目具体的研究结果如下：（1）用酵母双杂交和体外pull-down实验验证MANF与泛素连接酶RNF2的相互作用，发现两者有直接的相互作用。（2）免疫组化和免疫荧光双标实验检测RNF2在缺血再灌注脑组织中的表达和分布情况，确定缺血损伤可使RNF2表达上调，并在神经元和星形胶质细胞中高表达，且与MANF表达模式一致，两者存在共定位。（3）观察RNF2在体外培养神经元细胞在TM刺激、氧糖剥夺再灌注模型(OGD/R)中的表达情况，发现TM刺激、和OGD/R处理细胞RNF2和MANF表达均上调，且有两者均入核现象，而RNF2对MANF的mRNA水平无影响，提示RNF2对MANF存在蛋白修饰作用；（4）N2A细胞中分别转染RNF2-myc和RNF-siRNA质粒，TM刺激细胞，观察到过表达或沉默RNF2对MANF的表达有调节作用，且服从计量依赖。过表达或沉默RNF2对TM刺激、氧糖剥夺再灌注模型(OGD/R)处理N2A细胞，发现RNF2通过抑制caspase 3的激活来抑制神经细胞的死亡，具有神经保护作用。N2A细胞中共同转染MANF-flag和RNF2-myc质粒，Co-IP实验证实过表达RNF2，与RNF2相互作用的MANF蛋白增多，且单泛素化增强。上述结果提示，RNF2可上调MANF的表达，通过单泛素化修饰MANF蛋白，使其稳定不易降解，并且RNF2通过抑制caspase 3的激活来抑制神经细胞的死亡，从而起到神经保护作用，故脑缺血时RNF2可通过与新型神经营养因子MANF 相互作用介导神经的保护作用。