东方拟无枝酸菌中卟啉类化合物的生物合成及其与重要次级代谢产物之间的关系

Porphyrin compounds are important small-molecular cofactors widespread in organism. In our previous study,the negative correlation between the level of porphyrin compounds and the yield of important secondary metabolites such as vancomycin and ECO-0501 was first found in the vancomycin-producing strain Amycolatopsis orientalis HCCB-10007 when the bacterial culture conditions have changed in our lab. To illustrating this correlation, the work will be carried out as follows: First,the biosynthetic genes of porphyrin compounds would be predicted based on bioinformatics analysis of whole genome, then experiments will be done to confirm the predicted pathway.Second, the mechanism of the accumulation of the porphyrin compounds in the strain will be studied and the relationships between the accumulation of prophyrin compounds and the biosynthesis of the secondary metabolites will be illustrated based on the methods of the transcriptomics and the metabolomics study. On the basis of described above, we will attempt to regulate heme biosynthesis through genetic engineering so as to improve the yields of two important secondary metabolites. Combining the process of molecular regulation,other unknown secondary metabolites affected by the heme biosynthesis will be explored and mined.

卟啉是生物体中广泛存在的、起重要辅助作用的小分子。在我们的研究中首次发现，当培养条件改变后，万古霉素工业生产菌株东方拟无枝酸菌HCCB-10007中卟啉类化合物的含量与主要次级代谢产物（万古霉素和ECO-0501）产量之间呈负相关性。为了阐明这种"相关性"，首先，本课题将以全基因组信息为基础，通过生物信息学分析预测该菌中卟啉可能的生物合成基因；随后实验鉴定该菌中卟啉的生物合成途径。然后，探索造成该菌中大量积累卟啉类化合物的生物机理；并通过转录组学和代谢组学分析，探索卟啉类化合物与主要次级代谢产物（万古霉素、ECO-0501）合成之间的关系。在此基础上，通过基因工程对血红素的生物合成进行调控，以提高两个主要次级代谢产物的产量；同时，结合分子调控过程，探索和挖掘受其影响的其他未知次级代谢产物。

卟啉是生物体中广泛存在的、起重要辅助作用的小分子。血红素，作为重要的卟啉类化合物，不但参与能量代谢和压力响应系统，还参与复杂的酶反应和调控过程。本项目以东方拟无枝酸菌全基因组信息为基础，详细分析了参与血红素合成的15个基因，这些基因分散分布于基因组中。通过实验阐明其生物合成途径：由C5途径合成的ALA为起始，共有9种酶HemA1、HemL、HemB、HemC、HemD、HemE、HemN、HemY/G和HemH参与。首次发现hemN有未见报道的同工酶存在以及负责ECO-0501前体ALA合成的Shemin途径对万古霉素的合成有调控作用。有些关键基因如HemC和HemE还参与血红素以外的为菌体生长必须的合成途径。通过人工敲除关键基因hemN和过表达hemE重现因培养基组分改变而出的卟啉化合物大量积累的现象，进一步证明氮源的改变对卟啉化合物合成的调控作用很可能发生在粪卟啉合成前后的催化反应上。研究表明不同的关键基因对已知化合物万古霉素和ECO-0501以及其它未知化合物的调控水平不同，充分说明该菌中血红素合成途径的复杂及次级代谢的多样性。并将这些发现应用到产量提高上，万古霉素的产量最终提高2倍以上。我们还发现这种辅因子对次级代谢的合成具有普遍性，因此将这种调控应用到其它链霉菌中，如提高了达托霉素前体及纳他霉素的产量。在项目研究期间，我们进一步完善了东方拟无枝酸菌的遗传操作系统：首次引入了Isce-I介导的无标记敲除系统及人工构建了该菌的ΦC31介导的位点特异性重组系统，并鉴定了内源环型质粒的复制区从而开发成为可用于拟无枝酸菌属的复制型穿梭载体。在国内核心期刊发表论文3篇，1篇SCI论文已投稿， 1篇国际会议展板，1篇国际会议报告。