p66shc通路在肠缺血再灌注多器官损伤发病机制中的作用及其防治靶点的研究

肠缺血再灌注（IIR）是多器官功能障碍综合征的始动因素，发病机制复杂。我们早期的研究表明，NFκB和Keap1-Nrf2/ARE参与了IIR肝肺损伤的发病过程；蛋白酶体抑制是其重要的损伤保护环节；但在这一过程中，各种因子和通路相互交叉、重叠和串扰，其中，p66shc起到重要作用。据此，本研究利用p66shc基因敲除鼠建立IIR肝肺损伤和Caco2细胞缺氧复氧模型，采用免疫组化，Western Blot，RT-PCR等分子生物学方法，探讨p66shc通路在肠缺血再灌注肝肺损伤发病机制中的作用；研究调控p66shc的作用位点和各种感受分子信号（如Nrf2、MK2、ERK）的交叉、串扰关系；研究PKCβ抑制剂及多酚类化合物酪醇对p66shc、以及S36、MnSOD、bcl-xl、FLICE、GSH相关酶等的影响，进而探讨利用该通路作为肠缺血再灌注多器官功能损伤治疗策略的靶点。

肠缺血再灌注（II/R）是多器官功能障碍综合征（MODS）的始动因素，发病机制复杂。衔接蛋白p66shc是细胞内调节氧化应激和细胞凋亡的重要因子，并可能参与了II/R诱发MODS的过程，本研究通过体内和体外实验探讨了p66shc信号通路在II/R肝肺损伤发病机制中的作用及其相关防治靶点的研究。结果发现：（1）小鼠小肠I/R后肺组织中p66shc丝氨酸36位点磷酸化活化程度显著升高，经多酚化合物原儿茶酸（PCA）预处理，小肠I/R导致肺组织p66shc磷酸化状态受到明显抑制，并对疾病模型起到保护作用，且该保护作用与抗氧化系统GSH活化、抗氧化酶MnSOD和抗凋亡蛋白Bcl-xL的上调表达相关。（2）PCA对小鼠小肠I/R损伤和继发性肝脏损伤有保护作用，且该保护作用与抑制p66shc的磷酸化及调控下游抗氧化和抗凋亡因子的表达相关。（3）PKCβII亚型在小鼠小肠I/R后发生特异性激活，鲁伯斯塔对小肠I/R损伤起保护作用，这种保护作用可能是通过抑制PKCβII细胞膜转位及磷酸化活化，进而抑制p66shc的激活实现的。而在体外Caco2细胞缺氧复氧模型中siRNA-PKCβII和鲁伯斯塔均显著抑制p66shc的过表达及磷酸化激活，由此选择性抑制PKCβII可减轻p66shc介导的氧化应激损伤及随后的细胞凋亡，对小肠缺血再灌注损伤起保护作用。（4）小鼠小肠I/R可引起肝、肺组织中PKCβII的激活以及p66shc发生磷酸化，使p66shc发生线粒体转位，增强其与细胞色素C的结合，并促进细胞色素C的释放。利用LY333531特异性抑制PKCβII的激活可使p66shc蛋白磷酸化水平降低，进而抑制其线粒体转位、与细胞色素C的结合及诱导细胞色素C的释放，有效减轻肝肺病理损伤、肝脏和肺脏的氧化应激和细胞凋亡进而对小肠I/R致远隔肝肺损伤发挥保护作用。本研究提示：p66shc信号通路参与了 II/R致MODS的病理过程，该通路可以作为防治 II/R 疾病过程的重要靶点，PKCβII抑制剂及多酚类化合物可通过抑制该通路发挥重要保护作用。